Действие дефензина α-1 человека на трипомастиготы и амастиготы Trypanosoma cruzi in vitro

• Автор: Клещенко, Юлия Евгеньевна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 97 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Морфология и жизненный цикл Trypanosoma cruzi

1.2. Т. cruzi и болезнь Шагаса

1.3. Защитные реакции человека па инфицирование Т. cruzi и

противодействие возбудителя иммунному ответу

1.4. Дефензины млекопитающих как один из факторов врожденного

иммунитета
1.5. Активность а-дефензинов против микроорганизмов (антибактериальная, антивирусная, антипротозойная)
1.6. Структура и механизмы действия а-дефензинов
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Штаммы Т. cruzi, линии перевиваемых и культивируемых клеток
млекопитающих, сыворотки
2.2. Пептиды
2.3. Изучение действия дсфснзина а-1 человека на жизнеспособность
Т. cruzi in vitro
2.4. Деполяризация цитоплазматических мембран Г. cruzi для изучения
взаимодействия с ними дефензина а
2.5. Электронная микроскопия
2.6. Анализ фрагментации ДНК Т. cruzi, вызванной действием
дефензина а
2.7. Анализ деполяризации плазматических мембран Т. cruzi,
вызванной действием дефензина а

2.8. Анализ инвазивности Т. cruzi для клеток HeLa
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Действие дефензина а-1 человека на жизнеспособность
Т. cruzi in vitro
3.1.1. Действие дефензина а-1 человека на жизнеспособность
Т. cruzi in vitro в культуральной среде
3.1.2. Действие дефензина а-1 человека на жизнеспособность
Т. cruzi in vitro в крови мыши
3.2. Действие дефензина а-1 на ультраструктуру Т. cruzi
3.2.1. Ультраструктурные изменения мембран трипомастигот Т. cruzi
под действием дефензина а
3.2.2. Формирование мембранных нор под действием дефензина а
у трипомастигот Т. cruzi
3.2.3. Изменения внутриклеточных ультраструктур трипомастигот
Т. cruzi под действием дефензина а
3.2.4. Распределение дефензина а-1 в клетках трипомастигот
Т. cruzi
3.3. Фрагментация ДНК трипомастигот Т. cruzi, вызванная действием
дефензина а
3.4. Действие дефензина а-1 на инвазивную активность
трипомастигот Т. cruzi для клеток HeLa
3.5. Деполяризация плазматических мембран трипомастигот
Т. cruzi под действием дефензина а
3.6. Обсуждение результатов исследований
ВЫВОДЫ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
нм - нанометр мкм - микрометр мг - миллиграмм мкг - микрограмм мл - миллилитр ч
мин. - минута
рМ — микромолярный
пМ - наномолярный
m/z - отношение массы к заряду
Рис. - рисунок
КП - контрольный пептид
нк - ЭМ - негативный контраст, элетронная микроскопия нк-иммуноголд — ЭМ — негативный контраст, иммуноголд, электронная микроскопия
СЭМ — сканирующая электронная микроскопия
ТЭМ - трансмиссионная электронная мискроскопия
ПЦР - полимеразно-цепная реакция
ПКС - программируемая клеточная смерть
ВИЧ - вирус иммунодефицита человека
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
КЦ - карбонил-цианид-m- хлор-фенилгидразон
Культ, среда - культуральная среда
FACS - проточная цитометрия
EL1SA - иммуноферментный анализ
DMEM — среда Дульбекко
Т. cruzi — Trypanosoma cruzi
Т. rangeli - Trypanosoma rangeli
TLR - толл-подобный рецептор
IL - интерлейкин
встречающиеся во всех известных белках
Синтетические пептиды были получены в Genemed Synthesis (San Francisco,
CA).
2.3. Изучение действия дефензина а-1 человека на жизнеспособность T. cruzi
Для исследования действия от 3,7 рМ до 35 рМ дефензина а-1 человека на жизнеспособность Т. cruzi трипомастиготы или амастиготы (2х106/мл) инкубировали в культуральной среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с различными дозами пептида, а также дополнительно с ослиными антителами к дефензину а-1 или контрольной неспецифической сывороткой (MBL International Corp., Woburn, MA) в течение 1 ч. при 37 °С. В контрольных экспериментах паразитов инкубировали или с контрольным образцом или только в культуральной среде в таких же условиях. Количество убитых трипомастигот или амастигот определяли под микроскопом (Villalta F. et al., 1998), используя следующую формулу: % убитых трипаносом = [1 - (число живых паразитов после инкубации/число живых паразитов в культуральной среде)]х100. Каждый эксперимент был выполнен в трипликате, а также воспроизведен три раза.
Для изучения действия дефензина а-1 на трипомастиготы, выделенные из крови инфицированных мышей (3 х 106/мл в цитрате натрия - 1,5% ), инкубировали с 25 рМ дефензина а-1 или без него в течение 24 ч. при 4 °С. Эксперименты были выполнены 3 раза в трипликате для каждого условия.
2.4. Деполяризация цитоплазматических мембран Т. cruzi для изучения взаимодействия с ними дефензина а
Для изучения взаимодействия дефензина а-1 человека с клеточной мембраной трипомастигот, их предварительно инкубировали с карбонил-цианид