Методология и результаты молекулярно-генетического изучения вакцинного штамма Francisella tularensis

• Автор: Павлов, Виталий Михайлович
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Оболенск
• Количество страниц: 252 с. : ил.

С ОДЕРЖАНИЕ

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛС 7 ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Туляремийная инфекция - общие сведения

1.2. Таксономия рода ГгапФэеПа

1.3. Геном Г. tula.ren.sis

1.4. и плазмиды

1.5. Факторы патогенности Р. Ы1агепз1з

1.6. Генетические и генно-инженерные методы исследования 37 бактерий Р. ш1агепзР

1.6.1. Клонирование генов

1.6. 2. Мутагенез А. Шкггетчз'

1.7. Туляремийные вакцины
1.7.1. Вакцины, приготовленные из убитых клеток
1.7.2. Химические вакцины
1.7.3. Живая туляремийная вакцина
1.8. Рекомбинантные вакцины
1.9. Характеристика белков - протективных антигенов возбудите- 52 ля туберкулеза
1.10. Заключение по обзору литературы 54 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2 . МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Штаммы микроорганизмов, плазмиды и праймеры
2.2. Среды и условия культивирования бактерий
2.3. Лабораторные животные
2.4. Генно-инженерные методы
2.5. Биохимические и имунохимические методы исследований
2.6. Иммунобиологические методы исследований
2.7. Гистологические исследования

2.8.Статистические методы
Глава 3. КРИОТРАНСФОРМАЦИЯ, МОБИЛИЗАЦИЯ И КОНЪЮГА-
ЦИЯ ПЛАЗМИД В КЛЕТКИ ВАКЦИННОГО ШТАММА ■КШЫКЕЫШ 15/
ЗЛ!; Криотрансформация туляремийного микроба
3.2. Влияние структуры плазмид на трансформацию клеток
А. Ы1агепш 15/
3.3. Мобилизация плазмид в клетки вакцинного штамма 88 Р. Магетю. 15/
3.4. Конъюгационный перенос плазмиды рва в клетки вакцинного 94 штамма А. ййагепз^ 15/
ГЛАВА 4.СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ
КРИПТИЧЕСКОЙ ПЛАЗМИДЫ РГИПО
4.1. Выделение и первичная характеристика криптической плаз- 104 милы рЕМЫО
4.1.1. Определение нуклеотидной последовательности и об-
щая характеристика плазмиды рИЧЬЮ
4. 1.2. Область начала репликации плазмиды рЕМЛО
4.1.3. Анализ структуры белков, кодируемых ОРТ Ю
4.1.4. Промоторные области на плазмиде рЕМ/10
4.1.5. Локализация терминаторов транскрипции Ш
4.2. Создание штамма .РЛн/агаш.Л5/10(рЕ№Л0)
4.3. Создание бирепликонных плазмид на основе плазмиды; ИЗ рЕКЫО.
4.4..Совместимость плазмид в клетках./7. й//дгаш',у И
4.5. Экспериментальное подтверждение наличия активных промо- 119 торов в плазмиде рЕНЬ
4.6. Экспериментальное подтверждение наличия терминатора 122 транскрипции в плазмиде рЕНЬ
4.7 Механизм репликации плазмиды рЕЕПЛ 0

4.8. Стабильность плазмиды
4.9. Оценка фунционального потенциала плазмиды pCSE
4.10. Обсуждение
ГЛАВА 5. ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ ПРОТЕК-ТИВНЫХ АНТИГЕНОВ В КЛЕТКАХ ВАКЦИННОГО ШТАММА F. TULARENSIS 15/
5.1. Экспрессия Fl-антигена чумного микроба и протективного антигена сибиреязвенного микроба в клетках штамма F. tularensis 15/
5.2. Экспрессия гена sodA М. tuberculosis в клетках штамма F. tularensis 15/
5.3. Экспрессия генов протективных микобактериальных антигенов в клетках F. tularensis 15/
5.3.1. Конструирование гена слитного белка FL-AG85B
5.3.2. Экспрессия рекомбинантного генаfbpb в клетках F. tularensis 15/
5.3.3. Конструирование гена слитного белка FL-85B-ESAT
5.3.4. Экспрессия рекомбинантного генаfl-fbpb-esat6 в клетках F. tularensis 15/
5.4. Обсуждение
5.5. Приложение к главе
ГЛАВА 6. АЛЛЕЛЬНОЕ ЗАМЕЩЕНИЕ В ХРОМОСОМЕ ТУЛЯРЕ-МИЙНОГО МИКРОБА
6.1. Конструирование плазмидных векторов pPV для аллельного обмена генов в хромосоме F, tularensis
6.2. Создание плазмиды для удаления гена iglC из хромосомы F. tularensis
6.3. Конструирование штаммов F. tularensis с делецией гена iglC
6.4. Конструирование штамма F. tularensis с модифицированным геном sodB

темы синтеза пуринов), аланин-рацемазе (фермент системы синтеза пепти-догликана), и термоиндуцибельной протеазе С1рВ снижает способность мутантных вариантов F. tularensis размножаться в мышиных макрофагах (Gray C. G. et al, 2002).
Известно, что клетки F. tularensis используют систему секреции типа I. Удаление компонента TolC, входящего в надмолекулярную- структуру, осуществляющую такой тип секреции, приводит к снижению вирулентности ту-ляремийного микроба, но не к снижению способности размножаться в макрофагах (Gil H. et al., 2006). По данным анализа генома штамма F. tularensis Schu4 гены, кодирующие бактериальные структуры, характерные для систем секреции типа III или IV, которые могли бы влиять на метаболизм макрофагов, не обнаружены (LarssonP. et al., 2005; Rohmer L. et al., 2007),
На поверхности бактерий штамма F. tularensis LVS обнаружены пиле-подобные структуры (Forestal C. A. et al., 2003). Их удаление приводит к подавлению диссеминации возбудителя, но не влияет на размножение бактерий в макрофагах (Forslund A. L. et al., 2006). Геном F. tularensis содержит семейство генов pil, необходимых для синтеза пилей IV типа (Тф) (Gil H. et al., 2004, Larsson Р. et al., 2005). Продукты группы генов pil штамма F. tularensis subsp. novicida, вероятно, участвуют в транспорте белков в окружающую среду (Hager A. J. et al., 2006) и являются факторами патогенности.
При культивировании F. tularensis в жидкой питательной среде Чемберлена происходит усиление синтеза капсульного вещества и пилеобразных структур типа IV (Cherwonogrodzky J. W. et al., 1994; Gil H. et al., 2004 ). Бактериальная культура, выращенная в таких условиях, становится более вирулентной для мышей (Cherwonogrodzky J. W. et al., 1994).
Среди 12 белков, секретируемых бактериями F. tularensis, выявлены ферменты каталаза-периоксидаза (KatG) , бактериоферрин (Bfr), белки DnaK и GroEL (Lee В. Y. et al., 2006). У бактерий F. tularensis subsp. novicida обна-