Биологическая характеристика протективного антигена, синтезируемого аспорогенным рекомбинантным штаммом Bacillus anthracis

• Автор: Попова, Полина Юрьевна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 118 с. : 22 ил.

Список принятых обозначений и сокращений

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГИСК - Федеральное государственное учреждение науки Госу-

дарственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича ГКПБ «М» - Государственная коллекция патогенных бактерий «Микроб»

ИИ - индекс иммунитета

ИЛ - интерлейкин(ы)

кДа - килодальтон

КФБ - капий-фосфатный буфер

ЛФ - летальный фактор В. anthracis

ОФ - отечный фактор В. anthracis

ПА - протективный антиген В. anthracis

ПЦР - полимеразная цепная реакция
ТИФА - твердофазный иммуноферментный анализ
ФМСФ - фенилметилсульфонилфлуорид
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
АТ - обозначение производных штаммов В. anthracis, лишен-
ных плазмиды pXOl AVA - anthrax vaccine adsorbed (вакцина сибиреязвенная адсор-
бированная)
AVP - anthrax vaccine precipitated (вакцина сибиреязвенная пре-
ципитированная)
Сар - фенотипический признак капсулообразования
CpG - cytosine-guanine prepeat dideoxynucleotides (цитозин-

гуанин дезоксинуклеотиды)
ЕА1 - extractable antigen 1, белок S-слоя В. anthracis
ELISA - enzyme linked immunosorbent assay (твердофазный имму-
ноферментный анализ) kb - kilobases (тысячи пар нуклеотидов)
LD5o - доза возбудителя, летальная для 50 % лабораторных жи-
вотных
MAPPKs - mitogen activated protein kinase kinases (митоген-
активируемые протеиновые киназы)
MyD88 - myeloid differentiation factor 88 (миелоидный фактор диф-
ференцировки 88) pag - ген, определяющий синтез протективного антигена
pagR - ген, определяющий синтез негативного регулятора PagR
SDS - sodium dodecyl sulfate (додецилсульфат натрия)
Spo - фенотипический признак спорообразования
TLRs - Toll-like receptors (толл-подобные рецепторы)
Тох - фенотипический признак токсинообразования

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Биологическая значимость протективного антигена и компонентов поверхностных структур сибиреязвенного микроба
1.2. Использование живых, химических и рекомбинантных вакцин
для профилактики сибирской язвы
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Штаммы микроорганизмов, использованные в работе
2.2. Питательные среды, реактивы и лабораторные животные
2.3. Микробиологические методы исследования
2.3.1. Определение стабильности основных биологических свойств рекомбинантного штамма В. anthracis in vitro
2.3.2. Определение протеолитической активности штаммов
В. anthracis
2.3.3. Реакция радиальной диффузионной преципитации
2.3.4. Определение способности сибиреязвенных культур к спорообразованию
2.3.5. Приготовление споровой взвеси
2.3.6. Подготовка иммунизирующих и тест-заражающих штаммов В. anthracis
2.3.7. Культивирование аспорогенного рекомбинантного штамма-продуцента протективного антигена
2.4. Биохимические методы исследования
2.4.1. Выделение и очистка протективного антигена из культурального фильтрата аспорогенного рекомбинантного штамма
2.4.2. Выделение и очистка белка S-слоя ЕА1

Недостатки, присущие лицензированным сибиреязвенным вакцинам (развитие побочных реакций, необходимость частых бустерных инъекций), стимулируют многих ученых предпринимать попытки их улучшения или создания новых препаратов. Идеальная вакцина должна содержать только хорошо охарактеризованные компоненты, защищать лабораторных животных от аэрозольного заражения возбудителем сибирской язвы, обеспечивать развитие напряженного иммунитета при минимальном (менее трех) количестве инъекций, не обладать реактогенностью.
Одним из приоритетных путей совершенствования вакцинопрофилактики сибирской язвы является использование в качестве продуцентов ПА микроорганизмов с клонированной детерминантой синтеза иммуногенного антигена - геном pag. Белковый продукт, выделенный из подобных культур, не будет содержать токсичных примесей ОФ и ЛФ.
Привлекательной моделью для конструирования безопасных продуцентов иммуногенного белка являются условно-патогенные и непатогенные бактерии -Escherichia coli, представители родов Salmonella и Lactobacillus. Сообщения об экспрессии детерминанты синтеза протективного антигена сибиреязвенного микроба в E. coli были сделаны V. Chauhan et al. (2001), P. Gupta et al. (1999), M. Laird et al. (2004), F. Vahedi et al. (2009), V. Bagheri et al. (2010). Авторами созданы и оптимизированы различные схемы очистки рекомбинантного протективного антигена из штаммов кишечной палочки (Gwinn W. et al., 2006; Lu J. et al., 2009; Wu G. et al., 2010). ПА, выделенный из генно-инженерных штаммов кишечной палочки, был иммуногенен для линейных мышей BALB/c, стимулировал выработку анти-ПА антител в высоких титрах и защищал от заражения вирулентными штаммами возбудителя сибирской язвы. На модели новозеландских белых кроликов и макак резус выявлена 100 % защита от заражения ди-плазмидным штаммом В. anthracis при иммунизации ПА, продуцируемым штаммом E. coli (Vahedi F. et al., 2009; Chawla A. et al., 2009). Рекомбинантный ПА, выделенный из клеток штамма E. coli, прошел первую фазу клинических испытаний. В качестве адъюванта использовали альгидрогель. Авторами было проведено комплексное исследование показателей гуморального и клеточного