Биология нового неассоциативного факультативно литотрофного представителя рода Azospirillum - Azospirillum thiophilum sp. nov.

• Автор: Лавриненко, Ксения Сергеевна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 132 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
, 1.1. Бактерии рода Azospirillum как представители азотфиксирующих

бактерий
1.2. История открытия Azospirillum
1.3. Характеристика бактерий рода Azospirillum
1.3.1. Экология
1.3.2. Таксономическое положение
1.4. Адаптационные механизмы микроорганизмов
1.5. Эколого-иммунологические исследования бактерий рода Azospirillum
1.6. Азотфиксация и нитрогеназный комплекс
1.6.1. Структура нитрогеназного комплекса и молекулярные основы азотфиксации
1.6.2. Влияние кислорода на активность нитрогеназного комплекса I 1.7. Применение на практике

1.8. Особенности метаболизма соединений серы у литотрофных прокариот
1.8.1. Механизм адаптации к среде обитания
1.8.2. Роль соединений серы в метаболизме серобактерий
1.8.2.1. Дыхательная цепь и ферменты серного метаболизма
1.8.2.2. Особенности дыхательных цепей литотрофных прокариот
1.8.3. Ферменты диссимиляционного серного метаболизма
1.8.3.1. Тетратионатформирующие тиосульфат: хиноноксидоредуктазы (тиосульфатдегидрогеназы)
1.8.3.2. Sox комплекс (TOMES)
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объект исследования и источник выделения
2.2. Методы исследования
2.2.1. Состав питательной среды для культивирования
2.2.2. Микроаэробное культивирование
2.2.3. Методы изучения морфологии и внутриклеточных включений
2.2.4. Получение клеточной суспензии и ферментных экстрактов
2.2.5. Определение общего количества белка
2.2.6. Методы определения продуктов превращения соединений серы
2.2.7. Оценки способности к азотфиксации
2.2.8. Анализ жирнокислотного состава на приборе Шерлок
2.2.9. Методы определения активности ферментов, участвующих в превращении восстановленных соединений серы
2.2.10. Определение активности ферментов цикла трикарбоновых кислот
2.2.11. Выделение и очистка малатдегидрогеназы
2.2.12. Электрофоретические исследования
2.2.12.1. Аналитический электрофорез
2.2.12.2. Определение гомогенности ферментных препаратов
2.2.12.3. Специфическое проявление малатдегидрогеназы
2.2.12.4. Определение молекулярной массы субъединиц малатдегидрогеназы
2.2.13. Определение молекулярной массы нативного фермента малатдегидрогеназы

2.2.14. Полярографический метод определения кислорода
2.2.15. Методы молекулярной биологии
2.2.15.1. Выделение и очистка хромосомной ДНК

2.2.15.2. Получение кДНК-копий (реакция обратной транскрипции)
2.2.15.3. Количественная PCR (PCR в реальном времени)
2.2.15.4. Определение нуклеотидной последовательности генов
2.2.15.5. Определение Г+Ц в ДНК
2.2.16. Филогенетический анализ
2.2.17. Статистическая обработка результатов ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Характеристика нового вида рода Azospirillum
3.1.1. Характеристика местообитания штамма BV-ST
3.1.2. Выделение в чистую культуру штамма BV-ST
3.1.3. Фенотипические характеристики штамма BV-ST
3.1.3.1. Особенности морфологии штамма
.3.1.3.2. Культуральные признаки
3.1.3.3. Источники углерода
3.1.3.4. Физиолого - биохимические свойства
3.1.3.5. Фиксация молекулярного азота
3.1.3.6. Состав жирных кислот
3.1.4. Филогенетический и генотипический анализ штамма BV-ST
3.2. Роль восстановленных соединений серы в метаболизме Azospirillum thiophilum
3.2.1. Окисление соединений серы в аэробных условиях
3.2.2. Влияние кислородного режима культивирования на рост Л. thiophilum и динамику окисления тиосульфата
3.2.3. Механизм окисления восстановленных соединений серы Azospirillum thiophilum в микроаэробных условиях роста

зависимость нитрогеназной активности от р02 представляет собой типичную колоколообразную кривую (Fay, 1992).
Ингибирующее действие 02 на процесс азотфиксации было отмечено еще на очень ранних стадиях исследования свободноживуших и симбиотических диазотрофных микроорганизмов. Нитрогеназа чувствительна к кислороду независимо от типа метаболизма у конкретного диазотрофа. Например, и аноксигенные, и оксигенные фототрофы эффективнее ассимилируют N2 при низкой концентрации экзогенного кислорода. Факультативные анаэробы (Bacillus polymyxa и Klebsiella pneumoniae) или микроаэрофилы (МусоЪас-

terium fiavum) осуществляют индукцию нитрогеназной активности только в анаэробных или микроаэробных условиях, то есть без кислорода или при его низком парциальном давлении. В то же время эти бактерии способны расти в аэробных условиях, если в среде присутствует подходящий источник связанного азота. Нитрогеназа повреждается под действием кислорода вне зависимости от того, выделена ли она из облигатно-анаэробной бактерии (Clostridium pasterurianu) или из строго-аэробного микроорганизма A. vinelandii (Fay, 1992, Robson et al., 1980). Большинство диазотрофных фотосинтетических бактерий способно к фиксации азота на свету только при анаэробном культивировании. Эти факты также позволяют предположить, что нитрогеназная система возникла на заре эволюции, когда содержание 02 в атмосфере было еще низким.
Показано, что при экспонировании на воздухе необратимо инактивируются оба компонента нитрогеназы. Редукгаза динитрогеназы - наиболее чувствительный к кислороду компонент нитрогеназного комплекса. Динитрогеназа более стабильна, и время ее полужизни составляет около 4,5—10 мин (Fay, 1992).
Окислительное и дестабилизирующее действие на нитрогеназу оказывает не только кислород, но и его активные формы, участвующие в окислительном стрессе. Таким образом, нитрогеназа и кодирующие ее генные структуры негативно регулируются или повреждаются при контакте с кислородом.