Идентификация и внутривидовое типирование возбудителей сапа и мелиоидоза

• Автор: Антонов, Валерий Алексеевич
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 230 с. : 38 ил.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА I
ТАКСОНОМИЧЕСКОЕ ПОЛОЖЕНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПА, МЕЛИОИДОЗА И БЛИЗКОРОДСТВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ ГЛАВА II
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ВНУТРИВИДОВОЕ ТИПИРОВАНИЕ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ НА ОСНОВЕ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ
2.1. Лабораторная диагностика сапа и мелиоидоза
2.2. Вариабельные фенотипические признаки, применяемые
для внутривидовой дифференциации патогенных буркхольдерий ГЛАВА III
ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ БЛИЗКОРОДСТВЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ В. cepacia, В. thailandensis и В. psendomallei-like spp.
3.1. Идентификация бактерий комплекса В. cepacia на основе 57 принципа полифазной таксономии
3.2. Анализ биологических свойств штаммов В. thailandensis и 62 В. pseudomallei-like spp. (Ленкоранских штаммов)
ГЛАВА IV
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДЕТЕКЦИИ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ
4.1. Перспективные ДНК-мишени для генодиагностики пато- 71 генных буркхольдерий
4.2. Конструирование амплификационных тест-систем для 82 идентификации В. mallei и В. pseudomallei.
4.2Л. Характеристика олигонуклеотидных праймеров для идеи- 82 тификации патогенных буркхольдерий, сконструированных на основе генов fliC, orf 13, 16S рРНК и 23SрРНК
4.2.2. Подбор условий и оптимизация параметров реакции ам- 87 плификации
4.2.3. Определение аналитической чувствительности и специфич- 93 ности исследуемых олигонуклеотидных затравок
ГЛАВА V
ВЫЯВЛЕНИЕ БУРКХОЛЬДЕРИЙ В ОБЪЕКТАХ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ И ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ МЕТОДОМ ПЦР
5.1. Эффективность амплификационных тест-систем при ис- 107 следовании объектов внешней среды, искусственно контаминиро-ванных возбудителями сапа и мелиоидоза
5.2. Выявление В. mallei и В. pseudomallei при эксперимен- 115 тальной инфекции
5.2.1. Детекция возбудителей сапа и мелиоидоза при острой фор- 116 ме инфекции
5.2.2. Обнаружение патогенных буркхольдерий при хронической 120 форме инфекции
5.2.3. Применение реакции амплификации для обнаружения 128 В. thailandensis у экспериментально заражённых животных
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ВНУТРИВИДОВОГО ТИПИРОВАНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПА И МЕЛИОИДОЗА
6.1. Молекулярно-биологические подходы, используемые для 131 внутривидовой дифференциации штаммов В. mallei и B.pseudomallei
6.2. Генотипирование штаммов патогенных буркхольдерий с 146 помощью секвенирования
6.2.1. Дифференциация штаммов В. mallei и В. psendomallei на 146 основе секвенированных нуклеотидных последовательностей одиночных локусов
6.2.2. Мультилокусное сиквенс-типирование (МЛСТ) штаммов 157 возбудителей сапа и мелиоидоза
6.3. Изучение полиморфизма длины рестрикционных фраг- 170 ментов (ПДРФ) ДНК возбудителя сапа в формате пульс-электрофореза
6.4. ПЦР-типирование патогенных буркхольдерий
6.4.1. Внутривидовое типирование В. mallei и В. pseudomallei на 174 основе вариабельных ампликонов
6.4.2. Анализ генетического полиморфизма штаммов патогенных 180 буркхольдерий методом амплификации с произвольными праймерами
ГЛАВА VI

(RAPD)
6.4.3. VNTR-анализ возбудителей сапа и мелиоидоза

ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ
дНТФ - дезоксинуклеозидтрифосфаты
ДСН - додецилсульфат натрия
КОЕ - колониеобразующие единицы
ЛПС - липополисахарид
м.к. - микробные клетки
МКА - моноклональные антитела
МЛСТ - мультилокусное сиквенс-типирование
МФА - метод флуоресцирующих антител
оои - особо опасные инфекции
ПААТ - полиакриламидный гель
ПДРФ - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов
ПДАФ - полиморфизм длины амплификационных фрагментов
п.н. - пары нуклеотидов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ПЭФ - пульс-электрофорез
РА - реакция агглютинации
РИГА - реакция непрямой гемагглютинации
ТИФА - твердофазный иммуноферментный анализ
т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов
Трис - трис(гидрооксиметил)аминометан
ХЛИА - хемилюминесцентный иммуноанализ
ЭДТА - натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты
ВНI - агар на основе сердечно-мозгового перевара
BOX-PCR - амплификация ВОХ-повторяющихся нуклеотидных последовательностей
kDa - килодальтон
Md - мегадальтон
MLST - мультилокусное сиквенс-типирование
MLVA - мультилокусный анализ количества тандемных повторов
NCBI - национальный центр биотехнологической информации, США
ORF - открытая рамка считываяния
RAPD - амплификация с произвольными праймерами
SNP - полиморфизм единичных нуклеотидов
SSC - стандартный цитратно-солевой буфер
VAT - схема типирования на основе вариабельных ампликонов
VNTR - вариабельность количества тандемных повторов

отметить несколько характерных моментов, определяющих сложности их идентификации. В первую очередь они касаются присутствия близкородственных буркхольдерий со схожими биохимическими признаками в нестерильных объектах [189]. Так же, как и у возбудителя сапа, достаточно часто измененные биохимические профили В.pseudomallei вводят в заблуждение сотрудников практических лабораторий [197]. При отсутствии эпидемиологической настороженности в отношении возбудителей сапа и мелиоидоза использование лишь таких систем идентификации создает предпосылки для получения ложноотрицательных результатов.
P. Lowe с соавторами [244] отмечали высокую (99 %) точность идентификации В.pseudomallei с помощью системы API 20Е. Однако другими исследователями при изучении 100 изолятов возбудителя мелиоидоза с помощью данной системы достоверно микроорганизм идентифицирован в 50 % случаев при визуальном контроле результатов и в 63 % при анализе в компьютерном центре. Система Microbact 24Е была результативнее при идентификации возбудителя мелиоидоза (84 % и 100 %, соответственно). По этой причине именно Microbact 24Е в сочетании с компьютерной обработкой данных была рекомендована для дальнейшего использования [334].
D. A. Dance с соавторами [138] получены данные о высокой эффективности системы идентификации API 20NE. При сравнительном изучении эффективности API 20NE и API 20Е с автоматическими системами Vitek 1 and Vitek 2 возбудитель мелиоидоза определен в 98 %, 99 %, 99 %, and 19 % случаях, соответственно [244]. В то же время, T.J.J.Inglis с соавторами [193] отмечали случаи не достаточно корректной идентификации В. pseudomallei в API 20NE, которую с помощью этой системы определяли как Chromobacterium violaceum. При использовании системы BD Phoenix отмечены более существенные ошибки идентификации. Учитывая, что в базе данных этой системы отсутствует информация о возбудителе мелиоидоза, в 95-99 % случаев микроорганизм был определен как B.cepacia [218]