Разработка методических подходов для специфической индикации и идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза с помощью полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией

• Автор: Зинченко, Ольга Викторовна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 122 с. : 14 ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гибридизационно-флуоресцентные амплификационные тест- 14 системы в ДНК-диагностике инфекционных заболеваний

1.2. Молекулярно-генетические методы идентификации патогенных 24 буркхольдерий

1.3. Способы подготовки проб исследуемого материала и очистки ДНК 32 микроорганизмов для проведения генодиагностики
2.1. Штаммы микроорганизмов, питательные среды, условия культиви- 40 рования
2.2. Подготовка проб биологического материала, из объектов внешней 45 среды и пищевых продуктов для анализа методом ПЦР
2.3. Концентрирование клеток патогенных буркхольдерий на этапе под- 46 готовки проб из объектов внешней среды
2.4. Выделение ДНК
2.5. Постановка реакции амплификации с флуоресцентными олигонук- 51 леотидными зондами
2.6. Проведение электрофореза и флуоресцентная детекция продуктов 53 амплификации. Учет результатов ПЦР
2.7. Моделирование экспериментальной инфекции
2.8. Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. ПОДБОР ПРАЙМЕРОВ И ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ 55 ЗОНДОВ ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ ГИБРИДИЗАЦИОННО -ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ АМПЛИФИКАЦИОННЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ
3.1. Выбор и характеристика праймеров и гибридизационных олигонук- 55 леотидных зондов для обнаружения Burkholderia pseudomallei и Вигк-holderia mallei
3.2. Оптимизация условий проведения реакции амплификации на пре- 61 паратах ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ГЛАВА 4. ОЦЕНКА СПЕЦИФИЧНОСТИ
СКОНСТРУИРОВАННЫХ ПРАЙМЕРОВ И ЗОНДОВ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПА И МЕЛИОИДОЗА
ГЛАВА 5. ВЫБОР ОПТИМАЛЬНОГО СПОСОБА ПОДГОТОВКИ 82 ПРОБ ПОЧВЫ И ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ ДЛЯ ПОСЛЕДУЮЩЕЙ ПОСТАНОВКИ ПЦР
5.1. Определение эффективности различных способов очистки и выде- 82 ления ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза для их обнаружения методом ПЦР в пробах почвы и пищевых продуктов
5.2 Использование магноиммуносорбентов при исследовании проб
контаминированных патогенными буркхольдериями
ГЛАВА 6. ГЕНОДИАГНОСТИКА САПА И МЕЛИОИДОЗА ПРИ 91 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
дНТФ - дезоксирибонуклеозидтрифосфаты
кДа - килодальтон
КОЕ - колониеобразующая единица
МИС - магноиммуносорбент
м.к. - микробные клетки
МФА - метод флуоресцирующих антител
ОСО - отраслевой стандартный образец мутности
ПБА - патогенные биологические агенты
п.н. - пары нуклеотидов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РИГА - реакция непрямой гемагглютинации
СПЭБ - специализированная противоэпидемическая бригада
ТИФМ - твердофазный иммуноферментный метод
Трис - трис (гидроксиметил) аминометан
ЭДТА - натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты
ВНІ - агар на основе сердечно-мозгового перевара
ВБА - бычий сывороточный альбумин
ЕЬАБН - специфическая флуоресцентная гибридизация в процессе
амплификации
РЕЕТ - частотный резонансный перенос энергии
І4СВІ - национальный центр биотехнологической информации, США
БББ - додецилсульфат натрия
ТТБ - третий тип секреции

Ионы Mg2+ являются кофактором для Год-ДНК-полимеразы, от их концентрации также зависят чувствительность и специфичность амплификации. Секвестрация ионов Mg2+ различными компонентами и вмешательство ионов Са2+ может ингибировать реакцию. Ингибиторы оказывают тормозящий эффект путем прямого взаимодействия с ДНК или интерференции с термостабильной полимеразой и блокировки ее активного центра [104, 187].
Выбор полимеразы также имеет значение для предотвращения ингибирования [147, 276]. В настоящее время существует множество полимераз. Они берут свое начало из термофильных бактерий и отличаются по активности, точности, условиям работы. Чувствительность ферментов к различным ингибиторам стимулирует поиски новых, либо модификации при помощи генной инженерии известных термостабильных ДЕК-полимераз, амплифи-цирующих ДНК с большей точностью. Выработка ПЦР продукта может быть увеличена использованием в некоторых случаях смеси различных полимераз. Повысить выход реакции можно применением полимераз, которые менее подвержены действию специфических ингибиторов, чем другие. Полимераза AmpliTaq Gold является наиболее чувствительной к действию ингибиторов [43]. Увеличить эффективность реакции амплификации с данной полимеразой удалось добавлением в реакционную смесь BSA [101].
С целью контроля эффективности амплификации, которая снижается в присутствии ингибиторов, в исходную смесь вводят известное количество специально сконструированных ДНК или РНК. Эти последовательности ам-плифицируются вместе с определяемыми, но дают отличный от них сигнал. Ингибирование ПЦР, приводящее к ложноотрицательному результату, будет сразу замечено по отсутствию сигнала (флуоресцентная детекция) или полосы (электрофорез) внутреннего контроля [68, 230].
Одним из этапов пробоподготовки является обеззараживание исследуемого материала. Используемые в практике табельные средства стерилизации (растворы формалина, хлорамина, перикиси водорода и др.) не применяются при ПЦР-исследовании вследствие повреждающего действия на ДНК