Идентификация вируса инфекционной анемии лошадей на основе молекулярно-генетических методов

• Автор: Герасимова, Надежда Николаевна
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Вольгинский
• Количество страниц: 172 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
1 ВВЕДЕНИЕ
1.1 Актуальность темы
1.2 Степень разработанности проблемы
1.3 Цель и задачи исследований
1.4 Научная новизна результатов исследований
1.5 Теоретическая и практическая значимость работы
1.6 Степень достоверности и апробация результатов работы
1.7 Публикации
1.8 Структура диссертации
1.9 Основные положения диссертации, выносимые на защиту
1.10 Личный вклад соискателя в выполнение работы
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 Общая характеристика ретровирусов
2.2 Определение болезни, история и распространение
2.3 Характеристика вируса инфекционной анемии лошадей
2.3.1 Морфология и цикл репродукции вируса ИНАН
2.3.2 Структурная организация генома и полипептидный состав
2.3.3 Антигенная вариабельность
2.4 Эпизоотология вируса ИНАН
2.5 Патогенез и тропизм вируса ИНАН
2.6 Диагностика вируса ИНАН
2.6.1 Клиническая картина ИНАН
2.6.2 Гематологические исследования
2.6.3 Патологоанатомические и гистологические изменения
2.6.4 Постановка биопробы

2.6.5 Лабораторная диагностика ИНАН
2.6.5.1 Серологические методы диагностики
2.6.52 Идентификация вируса и молекулярногенетическая диагностика ИНАН
2.7 Дифференциальный диагноз
2.8 Иммунитет, средства борьбы и профилактики
2.8.1 Особенности иммунитета при ИНАН
2.8.2 Профилактика и меры борьбы
2.9 Изучение нуклеотидного состава и филогенетический анализ
вируса инфекционной анемии лошадей
2.10 Заключение по обзору литературы
3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 Материалы
3.1.1 Вирусы
3.1.2 Образцы клинического и патологического материала
3.1.3 Животные
3.1.4 Культуры клеток
3.1.5 Плазмида и бактериальные штаммы
3.1.6 Реактивы
3.1.7 Лабораторное оборудование
3.2 Методы
3.2.1 Подбор праймеров и зондов
3.2.2 Выделение нуклеиновых кислот
3.2.3 Синтез кДНК
3.2.4 Проведение гнездовой ОТ-ПЦР с детекцией результатов
амплификации методом электрофореза
3.2.5 Анализ продуктов ПЦР
3.2.6 Проведение ОТ-ПЦР в режиме реального времени
3.2.7 Нуклеотидное секвенирование
3.2.8 Компьютерный анализ нуклеотидных
последовательностей и филогенетический
анализ
3.2.9 Молекулярное клонирование продуктов ПЦР
3.2.9.1 Приготовление компетентных клеток E. coli линии DH5 Invitrogen DH5a F
3.2.9.2 Лигирование
3.2.9.3 Трансформация штамма E.coli DH5a
3.2.10 In vitro транскрипция
3.2.11 Серологические методы
3.2.12 Гематологические исследования
3.2.12.1 Подсчет общего количества лейкоцитов
3.2.12.2 Определение гемоглобина
3.2.13 Статистическая обработка результатов исследований
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Разработка тест-системы для выявления генома вируса ИНАН на основе гнездовой ОТ-ПЦР с детекцией результатов амплификации методом
электрофореза
4.1.1 Оптимизация состава и условий проведения реакции
4.1.2 Конструирование рекомбинантного положительного
контроля амплификации к тест-системе для выявления генома вируса ИНАН методом гнездовой ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией
4.1.3 Определение характеристик тест-системы на основе
гнездовой ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией
Разработка тест-системы для выявления генома вируса ИНАН
методом ОТ - ПЦР в режиме реального времени

исследования могут быть интерпретированы как ложноотрицательные [1, 20, 35, 107].
Об одном из таких случаев сообщается в исследовании итальянских ученых при вспышке ИНАН в Италии в 2006 году, когда методом РДП не удалось обнаружить присутствие инфицированных лошадей в течение обязательного 90-дневного карантина на одной из ферм, что привело к восьми новым случаям заболевания через 5 месяцев [137].
Другая проблема - присутствие в сыворотке антител, направленных против межвидовых разновидностей антигена р26, которые образуются в процессе эволюции лентивирусов. В результате их взаимодействия могут быть получены ложноположительные результаты [9, 35, 69].
У жеребят, рожденных от зараженных кобыл, в организме сохраняются колостральные антитела к вирусу ИНАН в течение 4-6 мес, и при исследовании таких животных также могут быть получены ложноположительные результаты. Поэтому молодняк исследуют серологическими методами только после отъема от матерей [22, 107,129, 131, 143, 154].
2.6.5.2 Идентификация вируса и молекулярно-генетическая диагностика ИНАН
Кроме серологических (косвенных) методов, для диагностики ИНАН необходимы чувствительные и специфичные экспресс-методы для прямого обнаружения вируса или его генома. Это обусловлено тем, что репликация вируса интенсивно идет в начале заболевания, и животное представляет значительную угрозу в качестве источника инфекции задолго до того, как стать серопозитивным. [60, 131, 138].
Для обнаружения и идентификации предлагается изоляция вируса на чувствительных культурах клеток.
Вирус ИНАН хорошо размножается в первичных культурах клеток лошадиного происхождения: костного мозга, фибробластов. Он также