Молекулярно-филогенетическое исследование видов подрода Esula Pers. рода Euphorbia L. : Euphorbiaceae Juss

• Автор: Крюков, Алексей Анатольевич
• Шифр специальности: 03.02.01
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 115 с. : ил.

Содержание
Введение
Благодарности
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Род Euphorbia L. и основные проблемы его систематики
1.2. Краткая история таксономического изучения рода 1° Euphorbia L.
1.3. История молекулярно-филогенетического исследования 14 рода Euphorbia
Глава 2. Материал и методы
Глава 3 Молекулярная филогения видов подрода Esula рода 47 Euphorbia
3.1. Результаты
3.1.1. Общая характеристика изученных последовательностей ITS 1- ген 5.8S rRNA- ITS2 видов подрода Esula рода 47 Euphorbia
3.1.2. Вторичные структуры ITS-последовательностей
3.1.3. Филогенетические реконструкции
3.2. Обсуждение
3.2.1. Объем подрода Esula
3.2.2. 72 Система подрода Esula и ее возможные изменения
Глава 4. Молекулярно-филогенетическое изучение секции 77 Holophyllum (Prokh.) Prokh.
Основные результаты и выводы
Список литературы
Приложения

Введение
Актуальность темы. Род молочай {Euphorbia L.) насчитывает до 2000 видов (Oudejans, 1990), широко распространенных в тропических, субтропических и умеренных областях Земного шара. По богатству жизненных форм этот род превосходит все остальные роды семейства молочайных. Все виды рода объединяет удивительное однообразие особой структуры, промежуточной между цветком и соцветием — циатия.
Первый и единственный на сегодняшний день обзор рода в полном объёме выполнил Э. Буасье (Boissier, 1862), который отнёс к нему 723 вида, разделив их на 27 секций. Существенный вклад в построение системы рода внёс Я. И. Проханов (1949, 1964) подготовивший его обработку для «Флоры СССР». Система рода и входящих в его состав подродов неоднократно менялась; не так давно Д. В. Гельтман (2007) на основании морфологических данных отнес евроазиатские виды изучаемого нами подрода Esula Pers. к 10 секциям.
Новым этапом в изучении систематики и филогении молочаев стали молекулярно-филогенетические работы, основанные на анализе и сравнении внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS) гена 45S rRNA, а также некоторых хлоропластных генов (Molero et al., 2002; Steinmann, Porter, 2002; Bruyns et al., 2006; и др.), что дало новые результаты, в ряде случаев существенно отличающиеся от принятых ранее. Наша работа находится в общем русле этого направления исследований (Мачс и др., 2005; Крюков и др., 2006, 2007, 2008, 2009, 2010; Родионов и др., 2008, 2009; Гельтман и др., 2010; Riina et al., 2013).
Цель и задачи исследования.
Цель работы:
Используя методы молекулярной филогении, исследовать филогенетические отношения видов подрода Esula рода Euphorbia,

определить степень родства и положение их на филогенетическом древе, сравнить полученные данные с имеющимися системами подрода.
Задачи исследования:
1. Провести секвенирование и сравнительный анализ района ITS 1— 5.8S pPHK-ITS2 ядерных генов 45S рРНК у ряда представителей подрода Esula рода Euphorbia, выявить частоту и спектр мутаций в этих районах и, используя методы молекулярной филогении, реконструировать возможные филогенетические отношения внутри исследуемой группы.
2. Провести анализ полученных филогенетических деревьев и их сравнение с имеющимися системами подрода, основанными на классическом подходе, предложить изменения этой системы.
3. Провести специальное молекулярно-филогенетическое исследование видов секции Holophyllum.
4. Построить вторичные структуры ITS1 и ITS2 для исследуемых видов и провести их анализ.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Секвенирован район ITSl-5.8SpPHK-ITS2 ядерного гена 45S рРНК у 93 видов подрода Esula, принадлежащих ко всем секциям подрода, распространенным во внетропической Евразии, в том числе для 74 видов— впервые. Также впервые показано достоверное деление видов подрода Esula на ряд клад, при этом лишь некоторые из них соответствуют секциям, выделяемым' по морфологическим признакам (Проханов, 1964; Гельтман, 2007). Впервые показано, что переход от многолетней формы к однолетней происходил в подроде Esula неоднократно.
Сведения, полученные в ходе данной работы, могут быть использованы при молекулярной идентификации видов подрода, имеющих практическое значение (в первую очередь лекарственных), а также при разработке учебных курсов по систематике и молекулярной филогении растений.

амплификации: 1 цикл: 5 мин 94 С; 35 циклов: 1 мин 94 С, 1 мин 56-58 С, 1 мин 72 С; 1 цикл: 10 мин 72 С.
Выделение полученного амплифицированного участка из агарозного геля проводилось согласно методике Фогелыптайна и Джиллеспи (Vogelstein, Gillespie, 1979), в том числе с использованием QIAquick GelExtraction Kit («Qiagen», Германия).
Проверка качества и количества ДНК проводилась по окончании этапов выделения геномной ДНК и амплификации необходимого фрагмента, а также при подготовке образца для секвенирования с помощью электрофореза в 1 % агарозном геле.
Для определения длины и концентрации фрагментов ДНК использовался маркер GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder plus (MBI Fermentas, Литва).
Установление нуклеотидной последовательности производилось с помощью секвенирования с использованием флуоресцентно меченых терминирующих элонгацию аналогов нуклеотидов, согласно методу Ф. Сэнжера и соавторов (Sanger et al., 1977). Секвенирование проводили на базе НПФ «Хеликс» на автоматическом секвенаторе ABI Prism377 DNA Sequencer («Applied Biosystems», США). Использовался набор реактивов ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing v2.0 («Applied Biosystems», США).
Анализ электрофореграмм проводился автоматически с последующей визуальной обработкой с помощью программы SeqScan v. 1.2.2 («Applied Biosystems», США). Анализ хроматограммы и перевод в нуклеотидную последовательность проводился вручную с помощью программы Chromas v.2.23 («Technelysium Pty Ltd», Австралия).
Секвенирование проводилось в обоих направлениях. При объединении последовательностей, полученных с разнонаправленных праймеров, использовались программы Chromas v.2.23 («Technelysium Pty Ltd», Австралия) и MEGA 4 - 5.01 (Tamura et al., 2011). Полученные