Копеечники (Hedysarum L.) Нижнего Поволжья : изменчивость и систематика

• Автор: Супрун, Наталья Александровна
• Шифр специальности: 03.02.01
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 160 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение

Глава 1. История изучения рода Hedysarum L. в Восточной Европе

1.1. Систематика рода Hedysarum

1.2. Гипотезы об эволюции копеечников секции Multicaulia

1.3. Проблемы систематики видов рода Hedysarum L. юго-востока европейской части России

1.4. Жизненные формы Hedysarum (sect. Multicaulia)

1.5. Особенности онтогенеза и структура ценопопуляций видов рода Hedysarum L. на территории юга Восточной Европы

1.6. Интродукция видов Hedysarum

1.7. Изучение генетических особенностей видов рода Hedysarum L

Глава 2. Материал и методы исследования
2.1. Материал и объекты исследования
2.2. Методы исследований
2.2.1. Методы изучения гербарного материала
2.2.2. Методы изучения в условиях интродукции
2.2.3. Методы изучения популяций
2.2.4. Молекулярно-генетические методы
2.2.4.1. Выделение ДНК
2.2.4.2. Параметры ISSR-ПЦР
Глава 3. Структура и динамика популяций видов Hedysarum на территории
Волгоградской области
3.1. Характеристика местообитаний видов Hedysarum
3.2. Онтогенетическая структура популяций видов Hedysarum в Волгоградской области
3.3. Структура популяций Hedysarum grandiflorum
3.4. Структура популяций Hedysarum cretaceum

Глава 4. Систематика и филогения видов рода Hedysarum sect.
Multicaulia
4.1. Морфологический анализ видов Hedysarum
4.2. Молекулярно-генетический анализ по данным ISSR
маркирования
4.3. Распространение Hedysarum ucrainicum Kaschm. на территории Волгоградской области
Глава 5. Интродукция и рекомендации по охране видов рода Hedysarum L
5.1. Перспективы выращивания некоторых видов Hedysarum в условиях Волгоградской области
5.2. Охрана природных популяций копеечников
Выводы
Литература
Приложение 1. Материал и объекты исследования
Приложение 2. Динамика онтогенетической структуры
Hedysarum grandiflorum и Hedysarum cretaceum на территории
Волгоградской области
Приложение 3. Средние показатели морфологических признаков популяций
видов Hedysarum
Приложение 4. Продукты амплификации ДНК видов Hedysarum с
различными праймерами
ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Копеечники (Hedysarum L.) - одна из весьма трудных в систематическом отношении групп в семействе бобовых (Fabaceae). Причиной тому является значительная морфологическая изменчивость многих видов и наличие морфологически переходных форм. Разделение на виды порой бывает затруднено из-за отсутствия четких диагностических морфологических признаков. Многие авторы расходятся в отношении систематического состава рода для территории юга Европейской части России. Последняя ревизия рода в полном объеме была предпринята Б. А. Федченко (1902), ревизию внутриродовой систематики, не затронувшую видовой состав секций, позднее опубликовали В. Choi и Н. Ohashi (2003). В связи с этим, необходимо возникает необходимость в изучении внутривидовой изменчивости видов на основании анализа всех признаков, использовавшихся систематиками, изучавшими виды с территории, как юга европейской части России, так и Волгоградской области.
Использование генетических маркеров часто оказывается решающим в таких таксономических исследованиях. Только на основе сопоставления данных молекулярно-генетического анализа и данных морфологии можно получить наиболее объективное представление о таксономических границах видов, а также решить проблемы, связанные с внутривидовой изменчивостью и гибридизацией.
Для прояснения систематического статуса близкородственных видов и разграничения морфологически сходных видов рода Hedysarum, в данной работе были использованы морфологические, ценопопуляционные и молекулярно-генетические методы (1SSR, секвенирование одного из участков хлоропластного генома).
В силу ряда причин (произрастание приурочено к выходам мела или известняка, лекарственное сырье, декоративность и т. д.) многие копеечники становятся редкими и нуждаются в охране, многие из них занесены в

водную фазу отбирали в чистую пробирку и добавляли 2/3 объема холодного изопропанола для осаждения ДНК. Содержимое пробирок перемешивали переворачиванием и оставляли на 1-3 часа при -20°С. ДНК осаждали центрифугированием в течение 5 мин. при 12000 об/мин, промывали 70% этанолом, подсушивали в термостате при 45 о С и растворяли в 50-100 мкл стерильной бидистиллированной воды.
Образцы ДЕК хранили при -20°С. Выход ДНК составил от 5 до 100 мкг на 0,1 г растительного материала.
2.2.4.2. Параметры ISSR-ПЦР
Для проведения фрагментного анализа ДНК были использованы межмикросателлитные маркеры (Inter Simple Sequence Repeats, ISSR), зарекомендовавшие себя как надежные и воспроизводимые в большом числе исследований по изучению популяционной структуры и гибридизационных процессов в природных популяциях разных видов растений (Wolfe et al., 1998; Archibald et al., 2004; Шанцер, Войлокова, 2008; Шанцер и др., 2011; Супрун, Шанцер, 2013).
В качестве праймеров для проведения ПЦР были использованы 9 олигонуклеотидных последовательностей, комплементарных
микросателлитным участкам генома. Состав и температуры отжига праймеров приведены в таблице 6.
Амплификацию проводили в стерильных 0,5 мл микроцентрифужных пробирках Эппендорф в 20 мкл смеси, содержащей около 20 нг ДНК, 60 мМ MgMix.
Амплификацию проводили в амплификаторе «Терцик MC-И» («ДНК-технология», Россия) и со следующими параметрами: Реакционная смесь (20 мкл) содержала 10-20 нг ДНК, 20 пикомоль праймера и 4 мкл готового реакционного микса MasterMix 5Х MagDDMIX-2025 (200 мкМ каждого dNTP,
1,5 мМ MgCh, 1,5 ед. Taq-полимеразы и буфер, Диалат ЛТД, Россия). ПЦР с предварительной денатурацией (95 °С - 3 мин) проводили в амплификаторе MJ