Биоинформационное исследование таксономического состава микробиоты кишечника человека

• Автор: Попенко, Анна Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.09
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 140 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. МЕТАГЕНОМИКА ЧЕЛОВЕКА: ИСТОКИ, РАЗВИТИЕ, ПЕРСПЕКТИВЫ
1.1 Начало метагеномных исследований
1.2 Микробнота кишечника человека: состав, функции и значение
1.3 Разнообразие здоровой микробноты кишечника
1.4 Микробнота кишечника человека при различных патологиях
1.4.1 Воспалительные заболевания и рак кишечника
1.4.2 Патогенные микроорганизмы и инновационные методы лечения
1.4.3 Метаболические патологии и роль микробиоты
1.4.4 Последствия приема антибиотиков для микробиоты кишечника
1.4.5 Генные маркеры патологических состояний
1.5 Методика проведения метагено.мных исследований
1.6 Актуальность метагено.мных исследований в Российской Федерации
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Забор образцов кала
2.2 Выделение ДИК нз кала
2.3 Методы ссквсинрования
2.4 Дополнительные мстагеиомныс данные
2.5 Предобработка ридов
2.6 Определение таксономического состава
2.7 Реализация алгоритма поточной обработки данных
2.8 Статистический анализ и визуализация
2.9 Моделирование производства и тока короткоценочечиых жирных кислот
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТАГЕНОМНЫХ ОБРАЗЦОВ: РАЗРАБОТКА МЕТОДОЛОГИИ II АНАЛИЗ
3.1 Реализация алгоритма поточной обработки метагеномных данных
3.2 Исследование российских метагеномных образцов от здоровых доноров
3.3 Исследование метагеномных образцов при патологиях
3.3.1 Метагеном пациентов, больных онкологическими заболеваниями
3.3.2 Метагеном кишечника людей, страдающих от алкогольной зависимости
3.3.3 Метагеном кишечника работников произвдетва с повышенным радиационным фоном
3.4 Создание кинетической модели производства и метаболизма короткоцепочечных жирных кислот поданным секвенирования генов 168 рРНК
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1 Создание программного комплекса но обработке метагено.мных данных
4.1.1 Фильтрация ридов
4.1.2 Картирование на референсный каталог геномов
4.1.3 Подсчет покрытия референсных последовательностей
4.1.4 Статистический анализ
4.1.5 Реализация программного комплекса
4.2 Анализ образцов нз Российского метагено.много проекта
4.3 Видовое разнообразие мстагеномов при различных диагнозах
4.4 Моделирование производства короткоценочечиых жирных кислот
4.5 Заключение
ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ИЛЛЮСТРАЦИЙ
ПРИЛОЖЕНИЕ
ПРИЛОЖЕНИЕ
ПРИЛОЖЕНИЕ
ПРИЛОЖЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
Наш мир представляет собой невероятно сложную экологическую сеть, работа каждого элемента которой выверена с точностью швейцарских часов. Но при этом вся эта система является единым живым целым, адекватно реагирующим на внешние условия и эволюционирующим. Каждый горячий источник, каждая лужа, моря, океаны, почва - все это части всемирной экологической сети. Их внутреннее устройство не проще экосистемы всей планеты. Несмотря на разнообразие условий, будь то земля, вода или кишечник животного, все эти экосистемы объединяет одно - наличие бактерий. На них приходится от половины до 90% всей биомассы нашей планеты1.
Бактерии, обитающие в одной экологической нише, образуют сложную систему межвидового обобщенного метаболизма, наиболее эффективно используют имеющиеся ресурсы, как то запасы питательных веществ, кислород, свет. Такие бактериальные конгломераты именуются микробиотой. Термин микробиота или микробном впервые был введен Джошуа Ледербергом и формально определяется как совокупность микроорганизмов, их генетического материала и взаимоотношений внутри экологической ниши2. Изучение микробных сообществ имеет фундаментальное значение: исследования общих и частных взаимосвязей внутри микробиоты, способов поддержания гомеостаза, механизмов ответа на раздражители внешней среды значительно расширят наши познания в области экологии и молекулярной биологии микробных сообществ. Микробиота человека интересна и с медицинской точки зрения. Наиболее многочисленной и разнообразной является микробиота кишечника человека. Микробиота человека интересна и с медицинской точки зрения. Наиболее многочисленной и разнообразной является микробиота кишечника человека.
Первым шагом в изучении микробиомов является определение их видового состава. Классические биологические подходы, такие как бактериальный посев или выделение отдельных клонов, весьма затруднительно использовать для этой цели ввиду большого количества видов, составляющих отдельный микробном, и

Kit, GS Titanium SV emPCR Kit (Lib-L) v2, GS Titanium LV emPCR Kit (Lib-L) v2 и GS FLX Titanium Sequencing Kit XL+.
Подготовку shotgun-библиотек и их секвенирование с использованием генетического анализатора HiSeq 2000 (Illumina) осуществляли согласно рекомендациям производителя с использованием наборов TruSeq DNA sample prep kit v.2, TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS TruSeq SBS Kit v3-HS с длиной чтения 101 п. н. с каждого конца фрагмента. Демультиплексирование проводилось с помощью программы CASA VA v. 1.8.2.
Подготовка фрагментной библиотеки ДНК и полногеномное секвенирование на платформе SOLiD 5500 W (Life Technologies, Foster City, CA, USA) были произведены в соответствие с инструкциями от производителя с применением следующих наборов: 5500 SOLiD Fragment Library Core Kit, 5500 SOLiD Fragment Library Barcode Adaptors 1-16, 5500 W Conversion Primers Kit, 5500 W FlowChip V2, 5500 W FlowChip Prep Pack, 5500 W Template Amplification Kit v2, 5500 W FWD1 SP Kit, Double, 5500 W FWD2 SP Kit, Double, 5500 W FWD SR Kit, Double, 5500 W FWD Ligase Kit, Double, 5500 W Run Cycle Buffer Kit, 5500 W FWD Buffer, Double, 5500 W Buffer D. Выходная длина ридов составила 75 п.н.
2.4 Дополнительные метагеномные данные
Для сравнительного анализа образцов российской кишечной микробиоты были использованы общедоступные метагеномные данные: 85 наборов ридов из Дании7, 1378 из США, 10 и 5 из Венесуэлы и Малави соответственно17, 6916 из Китая (Приложение 1).
2.5 Предобработка ридов
Полученные в ходе секвенирования риды в цветовом формате прошли стандартную фильтрацию по качеству. Риды со средним значением баллов качества QV<15 были исключены из анализа. С целью минимизации ошибок