Функциональный анализ лимфоцитарных белков человека FCRLA и FCRL6

• Автор: Кулемзин, Сергей Викторович
• Шифр специальности: 03.01.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 94 с. : ил.

Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность A.B. 'Гаранину, А.М. Наякшину, Л.В.Мечетиной, H.A. Чикаеву и всем сотрудникам лаборатории иммуногенетики за неоценимую помощь в подготовке данной работы. Также автор благодарит Е.С. Решетникову за помощь в подготовке препаратов для конфокальной микроскопии, Т.Г. Дужак за проведение масс-спектрометрического анализа, С.П. Сидоренко и М.Ю. Юрченко за помощь в проведении GST-pull down анализа.
Оглавление

Список основных сокращений 5 Введение

Актуальность исследования 6 Цели и задачи исследования 7 Научная новизна 7 Научно-практическая ценность 8 Апробация работы 8 Публикации 9 Вклад автора

Структура и объем диссертации

1. Обзор литературы

1.1 Дифференцировка и созревание В-лимфоцитов

1.2 Плазматические клетки и UPR (Unfolded Protein Response)

1.3 Механизмы транспорта белков из ЭР в аппарат Гольджи.

1.4 Рецепторы лейкоцитов и сигнальная трансдукция.
1.5 Лейкоцитарные Fc-рецепторы человека
1.6 FcR-подобные рецепторы человека
1.7 Характеристика внутриклеточного члена семейства FCRL - FCRLA
1.8 Связь FcR-подобных белков с истощением цитотоксических Т-лимфоцитов
1.8.1 Общая характеристика патологий, связанных с истощением цитотоксических Т-лимфоцитов
1.8.2 Ингибирующие рецепторы ЦТЛ, и их роль в патогенезе
1.8.3 FCRL6 - новый потенциально ингибирующий рецептор
2. Материалы и методы
2.1. Материалы и реактивы
2.2. Биологические материалы
2.3. Работа с эукариотическими клетками
2.3.1. Культивация эукариотических клеток
2.3.2. Выделение периферических мононуклеарных клеток крови
2.3.4 Химическая трансфекция эукариотических клеток.
2.4. Клонирование ДНК.
2.5 Выделение РНК и синтез кДНК
2.6 Электрофорез белков
2.6.1. Гель-электрофорез белков (ДСН-ПААГ) (Laemmli, 1970)
2.6.2. Синий нативный гель-электрофорез белковых комплексов (НС ПААГ). (по Shagger, 1991)
2.6.3. Гель-электрофорез белков (ДСН-ПААГ) во втором измерении, после СН-ПААГ
2.6.4. Окрашивание гелей при помощи нитрата серебра (по Shagger, 2006)
2.7. Иммуноферментный анализ (ИФА) (под ред. Фримеля, 1987)
2.8. Иммуноблоттинг
2.9. Иммунофлуоресцентной окрашивание и микроскопия
2.10 Дегликозилирование белков
2.11 Выделение микросом из клеток Bjab или лейкоцитов миндалины.
2.12 Мутагенез, с использованием мегапраймера по (Sarkar, 1990)
2.13 Аффинная очистка FCRLA-содержащих комплексов при помощи моноклональных антител.
2.14 Выделение FCRLA-содержащих комплексов при помощи тандемной аффинной очистки.
2.15 Масс-спектрометрический анализ белков FCRLA-содержащего комплекса.
2.16 Измерениие относительного уровня экспрессии РНК FCRL6 методом RealTime PCR.
2.17 Анализ белков взаимодействующих с цитоплазматической частью FCRL6.
2.18 Анализ коэкспрессии FCRL6 с другими поверхностными маркерами методом проточной цитометрии.
3. Результаты и обсуждение
3.1 Изучение функциональной активности изоформ FCRLA
3.1.1 Анализ экспрессии изоформ FCRLA
3.1.2 Исследование внутриклеточной локализации изоформ FCRLA
3.1.4 Исследование статуса гликозилирования изоформ FCRLA.
3.1.5 Сигнальный пептид отщепляется в процессе созревания большинства изоформ FCRLA.
3.1.6 Характер взаимодействия четырехдоменной изоформы FCRLA с мембраной ЭР.
3.1.7 Идентификация участка FCRLA, определяющего его локализацию в ЭР.
3.1.8 Определение молекулярной массы FCRLA-содержащего комплекса.
3.1.9 Взаимодействие FCRLAc иммуноглобулинами.
3.1.10 Поиск белков, взаимодействующих с FCRLA.
3.1.11 Обсуждение роли FCRLA в клетке.
3.2 Изучение функциональных свойств рецептора лимфоцитов человека FCRL6
3.2.1 Сигнальные свойства FCRL6 на модели in vitro.
3.2.2 Экспрессия FCRL6 при ВИЧ инфекции 73 Выводы
Список литературы 80 Приложение

2. Материалы и методы
2.1. Материалы и реактивы
В работе были использованы следующие материалы и реактивы:
2-меркаптоэтанол Fluka, Швейцария;
Антипротеиназный коктейль........................Pierce, США;
Affi-gel 10......................................Bio-Rad, США;
N, N'-метиленбисакриламид.........................Merck, Германия;
RPMI-1640.........................................Serva, Германия;
Агар..............................................Difco, США;
Агароза..........................................BioRad, США; FMC, США;
Акриламид.........................................Serva, Германия;
Бактотриптон Difco, США;
Бромистый этидий Serva, Германия;
Вектор pCI-neo...................................Promega, США;
Вектор pET21b....................................Novogen, США;
Глицерин.........................................Serva, Германия;
Глицин Sigma, США;
Гуанидин гидрохлорид Fluka, Швейцария;
Додецилсульфат натрия (ДСП) Fluka, Швейцария;
Дрожжевой экстракт. Difco, США;
Желатин...........................................Sigma, США;
Изопропил-l-THO-D-галактозид (ИПТГ)..............Serva, Германия;
Имидазол Fluka, Швейцария;
Казеин............................................Merck, Германия;
Конъюгат goat anti-rabbit (GAR)..................ИХБФМ СО РАН
(Лактионов П.П.), Россия;
Конъюгат rabbit anti-mouse (RAM).................ИХБФМ СО РАН (Лактионов
П.П.),
Россия;
Кумасси синий R-250..............................Ferak, Германия;
Кумасси синий G-250..............................Serva, Германия;
Нитроцеллюлозная мембрана Hybond-C Extra Amersham, Великобритания;