Разработка промышленной технологии производства пегилированных форм интерферона альфа-2a и альфа-2b

• Автор: Шамонов, Николай Алексеевич
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 163 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Интерферон. Общие сведения
1.2. Структура интерферона альфа-
1.3. Биологическая активность интерферона альфа-
1.4. Активация синтеза интерферона в клетках
1.5. Рецепторы интерферона альфа
1.6. Сигналы, вызванные действием интерферона на клетку
1.7. Клиническое применение интерферона
1.7.1. Общая информация
1.7.2. Терапия хронического гепатита В
1.7.3. Терапия хронического гепатита С
1.7.4. Терапия волосоклеточной лейкемии
1.7.5. Терапия саркомы Капоши
1.8. Требования качества к интерферон - содержащим препаратам
1.9. Недостатки использования нативного интерферона альфа-2
1.10. Создание лекарственных препаратов с пролонгированным дей- 28 стви-

1.10.1. Способы пролонгирования действия белковых молекул
1.10.2. Пегилирование. Общая информация
1.10.3. Химия пегилирования
1.10.3.1. Активированные ПЭГ первого поколения
1.10.3.2. Активированные ПЭГ второго поколения
1.10.3.2.1. Активированные ПЭГ второго поколения для модификации 37 аминогрупп
1.10.3.2.2. Активированные ПЭГ второго поколения для модификации
цистеинов
1.10. 3.2.3. Активированные ПЭГ второго поколения для модицифкации
окисленных карбогидратов

1.10.3.3. Реверсивное пегилирование
1.10.3.4. Гетерофункциональные активированные ПЭГ
1.10.4. Структура активированных ПЭГ
1.10.5. Влияние пегилирования на физико - химические и
биологические свойства белковых молекул
1.10.5.1. Влияние на гидрофильность, молекулярный вес и гидродина-
мический радиус
1.10.5.2. Влияние на конформацию
1.10.5.3. Влияние на заряд
1.10.6. Клиренс пегилированных препаратов
1.10.7. Токсичность ПЭГ
1.10.8. Критические параметры реакции пегилирования. Очистка пеги-
лированных белков
1.10.8.1. Очистка пегилированных белков за счет разницы в гидродина-
мическом радиусе
1.10.8.2. Очистка пегилированных белков за счет разницы в гидро-
фильности
1.10.8.3. Очистка пегилированных белков за счет разницы в заряде мо-
лекулы
1.10.9. Примеры использования пегилированных препаратов в меди-

1.10.10. Пегилированный интерферон альфа-2 - различные стратегии
1.10.10.1. Пегилированный интерферон альфа-2Ь (ПЕГИНТРОН)
1.10.10.2. Пегилированный интерферон альфа-2а (ПЕГАСИС)
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1.1. Материалы
2.1.2. Аналитические методы
2.1.2.1. Гельфильтрация на сорбенте БирегоБе
2.1.2.2. Ионообменная хроматография на сорбенте ТБ^еІ БР-5РУ
2.1.2.3. Метод обращенно-фазовой хроматографии
2.1.2.4. Метод электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии

лаурилсульфата натрия (в восстанавливающих и невосстанавливающих
условиях) с окраской нитратом серебра
2.1.2.5. Определение специфической активности
2.1.3. Препаративные методы
2.1.3.1. Растворение телец включения предшественника интерферона
альфа-
2.1.3.2. Процесс ренатурации интерферона альфа-
2.1.3.3. Предварительная очистка интерферона альфа-2 методом катио- 69 нообменной хроматографии на сорбенте СМ Берйагоье ИР
2.1.3.4. Процесс тонкой очистки интерферона альфа-2 методом катио-
нообменной хроматографии на сорбенте УМС Віорго Б
2.1.3.5. Процесс концентрирования интерферона альфа-2 методом кати- 70 онообменной хроматографии на сорбенте СМ ЗерЬагоье РР
2.1.3.6. Перевод очищенного іштерферона альфа-2 в буфер хранения 71 методом гель-фильтрационной хроматографии на сорбенте Бирегбех 75.
2.1.3.7. Процесс пегилирования интерферона альфа-2Ь
2.1.3.8. Процесс пегилирования интерферона альфа-2а
2.1.3.9. Процесс тонкой очистки пегилированного интерферона альфа-

2.1.3.10. Процесс тонкой очистки пегилированного интерферона альфа- 73 2а
2.1.3.11. Процесс концентрирования пегилированного интерферона
альфа-2 на сорбенте МасгоСар БР
2.1.3.12. Перевод очищенного монопегилированного интерферона аль- 74 фа-2 в буфер хранения методом гель-фильтрационной хроматографии
на сорбенте БерЬабех
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
2.2.1. Разработка технологии ренатурации телец включений интерферо-
на альфа-
2.2.1.1. Оптимизация процесса ренатурации телец включений интерфе-
рона альфа
2.2.1.2. Исследование влияния окисляющих и восстанавливающих аген-
тов на процесс ренатурации
2.2.1.3. Исследование влияния детергентов на процесс ренатурации
2.2.1.4. Исследование влияния иоешой силы раствора, концентрации
хаотропного агента и значения pH на процесс ренатурации
2.2.1.5. Исследование влияния дополнительных компонентов на про-
цесс ренатурации
2.2.1.6. Определение оптимальной нагрузки телец включений на рена-
турационный буфер

хлорофенилкарбонат, карбонилимидазол, сукцинимидилсукцинат. Структура данных активированных ПЭГ представлена на рисунке 5.
Дихлоротриазин ПЭГ реагирует с множественными нуклеофильными группами на поверхности белка: остатками лизина, серина, тирозина, цистеина и гистидина. В результате реакции один остаток хлора замещается на белковую молекулу с образованием вторичного амина. Показано, что второй атом хлора так же может принимать участие в реакции. В результате чего могут образовываться побочные кроссшитые продукты [137].
Трезилат ПЭГ более селективно реагирует с группами белка, чем дихлоротриазин ПЭГ, однако было показано, что он так же образуется гетерогенную смесь продуктов реакции по различным сайтам на поверхности белка. При этом часть из этих продуктов имеет сульфаминовую связь, которая легко гидролизуется в водных растворах [88].
Наибольшее распространение среди активированных ПЭГ первого поколения получили сукцинимидилкарбонат ПЭГ [90; 134] и бензотриазолкарбонат ПЭГ [37]. Данные реагенты реагируют преимущественно с е азотом остатков лизина с образованием карбамидной связи, но также способны реагировать с остатками гистидина и тирозина с образованием имидазолкарбамидной связи, которая подвергается гидролизу в водных растворах. Данный недостаток данных ПЭГ был использован для создания пролонгированных белковых препаратов с контролируемых высвобождением активного вещества, которые будут рассмотрены ниже.
П - нитрофенилкарбонат ПЭГ, трихлорофенилкарбонат ПЭГ и карбонилимидазол ПЭГ не получили широкого распространения за счет более низкой реакционной способности. Однако за счет снижения реакционной способности повышается селективность реакции [11; 117].
Сукцинимидилсукцинат ПЭГ содержит эфирную связь в цепи ПЭГ, которая после присоединения ПЭГ к молекуле белка может подвергаться гидролизу, в результате на поверхности белка может остаться сукцинатная группа, которая может привести к повышению иммуногенности белковой молекулы [25].