Особенности образования биопленок и Quorum Sensing регуляция при действии антибактериальных агентов

• Автор: Плюта, Владимир Александрович
• Шифр специальности: 03.01.06, 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 152 с. : ил.

I. ВВЕДЕНИЕ
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Микробные биопленки: общая характеристика и функции
Внеклеточный биопленочный матрикс, его состав и роль отдельных
компонентов
Мультимерные поверхностные клеточные структуры; роль в образовании
биопленок
Участие катионов металлов в адгезии и образовании биопленок
Роль циклического димерного гуанозин монофосфата (c-di-GMP) в регуляции формирования
биопленок
Биопленка Pseudomonas aeruginosa
Роль биопленок в инфекционном процессе. Резистентность бактерий, живущих в
биопленках, к антибактериальным агентам
Методы борьбы с микробными биопленками: подходы к профилактике образования или
разрушения биопленок
Преимущества использования биопленок в биотехнологии
Quorum Sensing системы регуляции экспрессии генов бактерий
QS системы регулирования и формирование биопленки Agrobaclerium tumefaciens
QS системы Р. aeruginosa
Ингибиторы QS систем регуляции
III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Среды и условия культивирования
2. Штаммы, плазмиды и олигонуклеотиды
3. Определение продукции АГЛ
4. Определения действия исследованных веществ на /нх-биосенсоры
5. Экстракция АГЛ из супернатантов культур и анализ экстрактов
6. Определение образования биопленок
7. Методы работы с ДНК
8. Перенос плазмид
9. Определение способности клеток бактерий к миграции по поверхности сред
10. Определение действия летучих органических соединений (ЛОС), продуцируемых бактериями, и индивидуальных ЛОС на формирование биопленок и зрелые биопленки А. tumefaciens С
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. Действие фенольных соединений на формирование биопленок Р. aeruginosa РА01 и А. tumefaciens С
4.1.1. Образование биопленок Р. aeruginosa РА01 и A. tumefaciens С58 в присутствии растительных фенолов
4.1.2. Определение синтеза АГЛ штаммом Р. aeruginosa РА01, при росте культуры на среде с различными концентрациями фенольных соединений
4.1.3. Действие фенольных соединений на биосенсоры на основе штаммов Escherichia coli, используемых для определения N-ацил-гомосеринлактонов
4.1.4. Определение способности клеток Р. aeruginosa РА01 к миграции в различных концентраций фенольных соединений
4.2. Действие фитогормонов на формирование биопленок Р. aeruginosa РА01 и А. tumefaciens С
4.3. Действие пероксида водорода и параквата на формирование биопленок Р. aeruginosa РА01 и A. tumefaciens С
4.3.1. Образование биопленок Р. aeruginosa РА01 и A. tumefaciens С58 в присутствии пероксида водорода и параквата
4.3.2. Влияние гена а НА, кодирующего гомосеринлактоназу, на образование биопленок Р. aeruginosa РА
4.4. Действие пероксида водорода на формирование биопленок Burkholderia cenocepacia
4.5. Действие летучих органических соединений (ЛОС), продуцируемых бактериями родов Pseudomonas и Serratia, и индивидуальных ЛОС на формирование биопленок и зрелые биопленки фитопатогенной бактерии Л. tumefaciens С
4.5.1. Определение действия ЛОС на функционирование Quorum Sensing систем регуляции
4.5.2. Определение влияния мутаций в генах, кодирующих порины OmpF и ОтрС, на чувствительность клеток E. coli к ЛОС
V. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
VI. ВЫВОДЫ
VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

I. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы исследования
Исследования последнего десятилетия показали, что большинство бактерий (более 99 %) существуют в природных экосистемах в виде специфически организованных прикрепленных к субстратам биопленок, образование которых представляет сложный, строго регулируемый биологический процесс.
Изучение биопленок вызывает огромный интерес исследователей; он связан, прежде всего, с тем, что способность патогенных бактерий существовать в составе биопленок создает большие трудности для медицинской практики, так как при этом значительно повышается устойчивость бактерий к действию антимикробных препаратов и факторов иммунной защиты организма-хозяина. Образование бактериальных биопленок часто является причиной тяжелых, трудно излечиваемых хронических заболеваний. В пищевой промышленности образование биопленок на продуктах увеличивает риск заражения пищи патогенными микроорганизмами; биообрастание трубопроводов, коммуникаций, оборудования, нефтяных платформ и, как следствие, биокоррозия этих поверхностей вызывают серьезные трудности в микробиологической и нефтеперерабатывающей промышленностях.
С другой стороны, образование биопленок может быть полезным, например, при биологической очистке воды. Кроме того, биопленки могут обеспечивать повышенную устойчивость бактерий-продуцентов к действию токсичных веществ, присутствующих в среде. Образование биопленок бактериями-антагонистами фнтопатогенов способствуют конкурентной борьбе этих бактерий с микроорганизмами - возбудителями заболеваний растений; этот фактор важен для развития эффективных методов биоконтроля.
Сказанное выше свидетельствует о важности изучения закономерностей образования биопленок и действия различных соединений на биопленки и их формирование. Исследования этой проблемы актуальны в фундаментальном отношеЕши и важны для медицины, биотехнологии и сельского хозяйства.
В настоящей работе изучеЕЕО действие нескольких групп веществ различной химической природы, которые, по нашему мнению, могли оказывать влияние на образование бактериальных бнопленок, но не исследовались ранее в этом отношении. Среди них вещества растительного происхождения - соединеЕШя фенольной природы с антимикробной активностью и фитогормоны. Исследовано также действие на образование биопленок и зрелые биопленки летучих органических соединений, синтезируемых бактериями,

Наиболее распространенная практика защиты трубопроводов, корпусов судов, нефтяных платформ и т.п. поверхностей погруженных в воду от биообрастания заключается в том, чтобы покрыть их антибиопленочными красками, содержащими биоциды. Например, было показано, что краски, содержащие дихлор-халкон, повреждали клеточные мембраны, снижали гидрофобность поверхности и ингибировали образование биопленки [271]. В прошлом, наиболее широко используемые и эффективные краски содержали в своем составе в качестве биоцида, главным образом, тяжелые металлы, такие как медь, свинец, ртуть, мышьяк, кадмий. Но многие из этих соединений представляют угрозу для морской экосистемы, поэтому в настоящее время идет поиск нетоксичных противообрастающих (антибиопленочных) соединений и выяснение молекулярных механизмов их действия. Четкое понимание механизма действия таких соединений предоставит важную информацию о чувствительных молекулярных мишенях и сигнальных путях, ответственных за процесс биообрастания. Эта информация может помочь при создании целевых биоанализов, использующих чувствительные биомаркеры для быстрого скрининга антибиопленочных соединений. В настоящее время противообрастающие соединения обычно подразделяют по механизму их действия на пять основных категорий: 1) ингибиторы ионных каналов; 2) ингибиторы Quorum Sensing систем; 3) блокаторы нейромеднаторов; 4) ингибиторы синтеза адгезинов; 5) ингибиторы ферментов, регулирующих выработку энергии или первичный метаболизм; 6) соединения с общим механизмом действия, для которых не были определены молекулярные мишени [121; 249; 271; 273].
Недавно была представлена скрининговая система, которую можно использовать для открытия новых соединений ингибирующих биопленки, на основе метода высокопроизводительного скрининга (анг. high-throughput screening method) за счет использования для получения изображений высокопроизводительной эпифлуоресцентной микроскопии (анг. high-throughput epifluorescence microscopy imaging). С помощью этой системы были определены новые натуральные продукты с активностью против биопленок Pseudomonas и Vibrio [242]. Два найденных соединения могли ингибировать образование биопленок и разрушать уже сформированные биопленки. Наконец, было показано, что одно из них обладает способностью повышать чувствительность уже сформированных биопленок к действию антибиотиков, в том числе к тетрациклину и ципрофлоксацину [145].
Признанной проблемой при борьбе с биопленками является наличие в них небольших, но значимых популяций персистентных клеток (персистеры), которые являются физиологически резистентными к антибиотикам (см. предыдущий раздел) [54]. Поэтому сокращение числа персистентных клеток в биопленках и одновременное введение сильнодействующих антибиотиков может быть эффективной стратегией борьбы при