Люминесцентные биосенсоры на основе иммобилизованных в криогеле поливинилового спирта фотобактерий

• Автор: Алескерова, Лейла Эльшадовна
• Шифр специальности: 03.02.03, 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 192 с. : ил.

Содержание
ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биология, экология и таксономия светящихся бактерий

1.2. Биолюминесцентная система бактерий - строение и функции

1.2.1. Реакции бактериальной люциферазы

1.2.2. Механизмы бактериальной люминесценции

1.2.3. Генетическая организация люминесцентной системы

1.2.4. Регуляция свечения

1.2.5. Биосинтез и функционирование в биолюминесцентном процессе

алифатических альдегидов
1.3. Биосенсоры
1.3.1. Микробные биосенсоры
1.3.2. Технология люминесцентного биомониторинга токсинов с
использованием фотобактерий
1.3.3. Интегральная биодетекция токсинов
1.3.4. Биосенсоры на основе 1их-маркированных и рекомбинантных
штаммов микроорганизмов
1.3.5. Биосенсоры на основе иммобилизованных клеток фотобактерий
1.3.6. Непрерывный биомониторинг токсинов с использованием
фотобактерий
1.3.7. Поливиниловый спирт как матрица для иммобилизации
микроорганизмов
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Бактериальный штамм
2.2. Условия выращивания. Среда культивирования
2.3. Получение биомассы
2.4. Технология иммобилизации фотобактерий в криогеле ПВС
2.5. Определение эмиссионной активности
2.6. Определение биомассы
2.7. Определение АТФ
2.8. Электронная микроскопия
2.9. Анализ токсинов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Физиологические и биолюминесцентные характеристики психрофильных бактерий Ркои>Ьас1ег1ит ркояркогеит Белого моря
3.2. Иммобилизация фотобактерий в криогеле поливинилового спирта
3.2.1. Технология иммобилизация фотобактерий в криогеле ПВС
3.2.2. Факторы стабилизации биолюминесценции при иммобилизации фотобактерий в криогеле ПВС
3.2.3. Анализ температурной и pH зависимости свободных и иммобилизованных клеток фотобактерий
3.3. Выживаемость иммобилизованных в криогеле ПВС клеток фотобактерий
3.4. АТФ-пул и биолюминесцентная активность у свободных и иммобилизованных клеток бактерий Рко^ЬаМегшт ркозркогеит
3.5. Иммобилизованные в криогели ПВС фотобактерии в биолюминесцентном мониторинг экотоксикантов

3.6. Анализ тяжелых металлов, хлорфенолов и пестицидов с использованием иммобилизованных препаратов
3.7. Иммобилизованные в криогеле ПВС фотобактерии в непрерывном биомониторинге токсинов
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
5. ВЫВОДЫ
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Ключивым элементом данной схемы является наличия долгоживущих интермедиатов. Интермедиат I формируется в результате взаимодействия фермента с ФМНН2, интермедиат II формируется в результате реакции интермедиата I с кислородом. По своей структуре интермедиат II является связанным с люциферазой 4-а-гидроперокси-4а-5-дигидрофлавином. Последующие взаимодействие интермедиата II с ЯСНО приводит к формированию интермедиата III, который является смешанным флавин-альдегид-пероксидом (пероксихемоацеталем). Последующие превращение интермедита III приводит к формированию эмиттера, который по данным ряда работ является 4-а-гидрокси-4а-5-дигидрофлавином.
Первая стадия, предшествующая возбужденному состоянию эмиттера, заключается в формировании высокостабильного флавин-гидроперроксида, связанного на люциферазе. Связанный на ферменте ФМНН2 защищен от автоокисления. Вторая стадия протекает при участии алифатического альдегида и приводит к формированию пероксихемиацеталя Е-РООА. Время жизни этого интермидиата определяет общую скорость реакции. В качестве эмиттера свечения постулирован связанный на ферменте 4-альфа-гидроксифлавин, который идентифицируется по его эмиссионному спектру. Квантовый выход биолюминесценции 0,3-0,5 йу по отношению к ФМНН2 [34; 35].
Существует диокситаноновый механизм. В соответствии с данным механизмом окисление люциферина включает перенос электронов на 0-0 связь с последующим ее разрывом и образованием возбужденного состояния ЯНС=0, в ходе распада которой генерируется свет и образуется С02 [140]. Более соответствующим процессу бактериальной люминесценции является так называемый С1ЕЕЬ (химически инициированная электронообменная люминесценция) [60] процесс. Данная схема также предусматривает формирование пероксиполуацетального интермедиата. В соответствии с этим механизмом гемолитический разрыв пероксидной связи приводит к