Поиск и изучение генетических детерминант, определяющих эффективность экспрессии гетерологичных генов в растениях

• Автор: Тюрин, Александр Александрович
• Шифр специальности: 03.02.07, 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 181 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ

1.1 Информационные ресурсы для хранения и анализа биологической информации растительных объектов
1.2 Генетические детерминанты, определяющие эффективность реализации генетической информации
1.2.1 Регуляторные элементы, обеспечивающие эффективность транскрипции генов в растениях

1.2.2 Детерминанты процессинга и сплайсинга пре-мРНК

1.2.3 Детерминанты, определяющие уровень экспрессии целевых генов в растениях на этапе трансляции

1.2.4 Эффективность трансляции в зависимости от кодонового состава генов

1.2.5 Детерминанты, определяющие уровень экспрессии целевых генов в растениях на этапе стабильности белкового продукта
1.2.6 Термостабильная лихеназа Clostridium thermocellum
1.3 Заключение. Постановка цели исследования
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Бактериальные штаммы
2.2 Растительный материал
2.3 Биоинформатический анализ. База данных FlowGene.az
2.4 Методы молекулярного клонирования
2.5 Трансформация бактерий
2.6 Агроинфильтрация растений табака N. benthamiana
2.7 Получение белковых лизатов
2.8 Анализ белковых лизатов

2.9 Активность интерферона
2.10 Конструирование модульного белок-стабилизируюшего партнёра на основе термостабильной лихеназы
2.11 Конструирование модельного гена эритропоэтина с модифицированным кодоновым составом
2.12 Конструирование гибридных генов, кодирующих рекомбинантный белок-стабилизирующий партнёр с интеграцией или слиянием с нативными и модифицированными вариантами генов интерферона-альфа-2А и эритропоэтина
2.13 Конструирование серии модульных векторов для транзиентной экспрессии целевых генов в растениях
2.13.1 Конструирование базового модульного вектора серии рУЮ-Т для транзиентной экспрессии гетерологичных генов в растениях
2.13.2 Конструирование модульных векторов, несущих генетические детерминанты
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Анализ 5'-нетранслируемой области
3.2 Анализ кодонового состава
3.3 Обеспечение стабильности белкового продукта
3.3.1 Вторая аминокислота
3.3.2 Конструирование белок-стабилизирующего партнёра на основе термостабильной лихеназы
Заключение
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ

Список сокращений
мРНК - матричная РНК 5’-НТО - 5’-нетранслируемая область З'-НТО - З’-нетранслируемая область
EST- Expression Sequencing Tag - фрагмент экспрессируемого гена
NGS - Next Generation Sequencing - технологии параллельного
секвенирования
ДЬ(ОВ) - база данных (Database)
Е. coli - Esherichia coli - кишечная палочка
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
кДНК (cDNA) - комплементарная ДНК
SNP - однонуклеотидный полиморфизм.
siPHK - малые интерферирующие РНК
SCL - SubCellular Localization - субклеточная локализация
GO - gene ontology - онтология генов
пре-мРНК - незрелая мРНК
1RES - сайт внутренней посадки рибосом)
тРНК- транспортная РНК
TSS — transcription start site - сайт начала транскрипции GTFs - общие факторы транскрипции
35S CaMV- промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты РБФК - рибулозо-бис-фосфат-карбоксилаза АС- альтернативный сплайсинг.
Е/Л'С-элементы - translation initiator of short 5' UTR - трансляционные инициаторы коротких 5'-НТО
uORFs - upstream open reading frames -открытые рамки считывания, локализованные выше основной
uAUGs - upstream start codons - стартовые кодоны, также локализованные

НТО) (ее размером, нуклеотидным составов и вторичной структурой); хорошим конткестом окружения стартового AUG кодона (A/GXXAUGG - для эукариот), а также наличием стартовый кодон AUG [Kozak, 1984; Kozak, 1986; Kozak, 1990; Pelletieret al., 1985].
Важным регуляторным элементов в инициации трансляции является вторичная структура 5’-НТО, непосредственно прилегающая к началу инициирующего AUG кодона. Эта структура представлена у многих мРНК, согласно компьютерному предсказанию. Так, большинство мРНК имеют небольшую вторичную структуру в 5’-НТО, но более расширенную структуру кодирующей области. Например, мРНК глобина имеет приблизительно 60% двойных участков, несмотря на то, что имеется 5’-НТО, которая теряет вторичную структуру, что обеспечивает эффективную экспрессию репортерной конструкции. Если вторичная структура действительно блокирует трансляцию, можно ожидать, что 5’-НТО должна быть неструктурированной и иметь размер не менее 150 п.н. Однако отмечены некоторые исключения из этих ожиданий. Длинные (и по предсказанию структурированные) 5’-НТО 35S РНК CaMV [Futterer et al., 1993] и аденовирусные мРНК содержат трехсторонний лидер, который, по-видимому, подвергается шунтированию рибосомой. В этом процессе, m7 G cap мРНК узнается, но затем большинство из промежуточных нуклеотидов (но, возможно не все) в 5’-НТО обходится для того, чтобы достичь инициирующий AUG кодон. Этот механизм имеет более современную интерпретацию, которая заключается в стебле-петлевом проскакивании во время нормального процесса сканирования для обнаружения стартового AUG кодона [Abaeva et al., 2011].
Другая серия мРНК, которая, по-видимому, не использует стандартный 80S путь трансляции, это мРНК с короткими 5’-НТО, которые охарактеризованы как TTSU элементы (translation initiator of short 5' UTR) [Elfakess et al., 2011]. Эти мРНК имеют 5’-HTO, которая варьирует от 1 до