Разработка системы фаговаров бактерий Bacillus cereus для идентификации и мониторинга данного микроорганизма

• Автор: Калдыркаев, Андрей Иванович
• Шифр специальности: 03.02.03, 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Ульяновск
• Количество страниц: 179 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Систематика и идентификация бактерий рода Bacillus
1.2. Бактерии рода Bacillus, обнаруживаемые в пищевых продуктах
1.3. Значение Bacillus cereus в пищевых отравлениях человека
1.4. Изучение вирулентности бактерий вида Bacillus cereus
1.5. Бактериофаги и их применение в лабораторной практике
1.5. 1. Морфология негативных колоний
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объекты, материалы и методы исследований
2.2 Результаты собственных исследований и их обсуждения
2.2.1 Изучение биологических свойств Bacillus cereus
2.2.1.1. Тинкториальные свойства Bacillus cereus
2.2.1.2. Изучение культуральных свойств Bacillus cereus
2.2.1.3 Изучение биохимических свойств Bacillus cereus
2.3 Выделение и идентификация бактерий вида Bacillus cereus
2.3.1 Оптимизация схемы выделения Bacillus cereus
2.4 Методы выделения и изучения биологических
свойств бактериофагов
2.4.1 Методы выделения бактериофагов Bacillus cereus
2.4.2 Селекция бактериофагов и повышение их
литической активности
2.4.3 Изучение основных биологических свойств выделенных
фагов бактерий Bacillus cereus
2.4.3.1 Морфология негативных колоний
2.4.3.2 Определение литической активности фага
2.4.3.3 Спектр литической активности
2.4.3.4. Специфичность действия исследуемых фагов

бактерий вида Bacillus cereus
2.5 Создание схемы фаготипирования
2.6 Изменение литической активности фагов при хранении
2.7 Конструирование и разработка технологических параметров изготовления и контроля индикаторного биопрепарата на основе специфичных бактериофагов Bacillus cereus
2.7.1 Получение индикаторных культур Bacillus cereus
2.7.2 Приготовление рабочей культуры материнского фага
2.7.3 Приготовление культур фагов для конструирования
биопрепаратов
2.7.4. Конструирование биопрепаратов
2.7.5. Контроль качества изготовленных биопрепаратов
2.8 Разработка параметров ускоренной идентификации
бактерий вида Bacillus cereus с помощью бактериофагов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ
ПРИЛОЖЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Бактерии Bacillus cereus относятся к —грамположительным факультативно-анаэробным, подвижным, спорообразую -щим, палочковидным бактериям, широко распространенным в окружающей среде (почве, пресной и морской воде, кишечнике беспозвоночных, на растениях и т.д.) и имеющим фенотипические и генетические (16S рРНК) признаки, сходные с рядом других видов бактерий рода Bacillus'. В. mycoides, В. pseudomycoides, В. thuringiensis и В. anthracis (Rasko et al., 2005; Han et al., 2006; Auger et al., 2009). Бактерии В. cereus способны при определенных условиях вызывать у человека широкий спектр заболеваний, включающих пищевые токсикоинфекции, системные и местные гнойные инфекции, в т.ч. молниеносный сепсис, менингит, абсцесс мозга, эндофтальмит, пневмонию, эндокардит, остеомиелит, кожную инфекцию по типу газовой гангрены и т.д., а у животных - мастит крупного рогатого скота (Musa et al., 1999; Brett et al., 2005; Darbar , Harris and Gosbell, 2005; Avashia et al., 2007; Abusin et al., 2008; Orthop et al., 2008). Основные факторы патогенности В. cereus связаны с выделением разрушающих ткани реактивных экзоферментов: гемолизинов, фосфолипаз, токсина вызывающего рвоту и энтеротоксинов (HBL, NHE, и цитотоксина К) (Ghelardi et al. 2007; Amesen et al., 2008; Edward, 2010).
Пищевую токсикоинфекцию с преобладающим диарейным синдромом вызывает употребление в пищу термически не обработанных мясных и рыбных блюд, немытых овощей, непастеризованного молока, в то время как контаминированный бактериями В. cereus (Ю5-Ю8КОЕ/г) рис и другие крахмал содержащие продукты, а также сыр вызывают гастроэнтерит с ведущим рвотным синдромом (Wijnands et al. 2006). По данным Центра по контролю и профилактике заболеваний (CDC Foodbome Outbreak Online Database) в США ежегодно регистрируется более 60 000 случаев заболеваний, вызванных бактериями В. cereus. При этом отмечается, что некоторым пациентам с рвотной симптоматикой при бациллярной пищевой инфекции ошибочно диагностируют

сегет размножаются в них и продуцируют экзотоксины. Под влиянием протеолитических и других ферментов, выделяемых В. сегет, в продуктах накапливаются различные ядовитые вещества (птомаины). Все это вместе взятое и приводит к развитию пищевого отравления-(-Бакулов,-с-сооав'[-2004);
Данные, свидетельствующие о продуцировании гиалуронидаз штаммами бактерий вида В. сегет, приводи т СгЛх и соавт (1974). Он изучал нарушение сосудистой проницаемости у кроликов после введения культуральных фильтратов
В. сегет. Фактор проницаемости в бесклеточных фильтратах изучаемых культур определяли: по степени распространения витального красителя (синьки Эванса) в коже белых кроликов, интенсивности экссудации в просвет перевязанного сегмента кишки кролика, величине некротической реакции у морских свинок. Вещества, обуславливающие все три вида активности, обнаруживались в фильтратах исследованных культур в логарифмической фазе роста при интенсивной аэрации, инактивировались нагреванием в температурном режиме 56 °С, недиализабельны, переходили в осадок при 40 - 60 % насыщении сульфатом аммония и нейтрализовались антисывороткой.
Более детальную характеристику энтеротоксина, вырабатываемого бактериями вида В. сегет представили ¥. Брша и I. ОоерБерг (1975). Сравнивая токсичность экстрактов из биомассы и препарата после обработки ультразвуком, авторы пришли к выводу о том, что энтеротоксин синтезируется активно растущими клетками и секретируется в среду независимо от процесса клеточного лизиса. Полученный энтеротоксин блокируется кроличьей антисывороткой, теряет активность после диализа и при алкилировании (Смирнов. Резник, Василевская, 1982).
О значительной распространенности гемолитических штаммов бактерий вида В. сегет свидетельствуют данные Акопяна, Африкяна (1967), согласно которым из 172 изученных штаммов гемолитической активностью характеризовались 146. Выделенные нами из объектов окружающей среды и пищевых продуктов 43 штамма бактерий вида В. сегет также обладают ярко выраженной гемолитической активностью.