Взаимодействие клеток бактерий с соединениями серебра и золота: влияние на рост, образование биопленок, механизмы действия, биогенез наночастиц

• Автор: Радциг, Марина Александровна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 119 с. : ил.

I. ВВЕДЕНИЕ
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ
ПЛ. ВВЕДЕНИЕ
11.2. АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ ЭФФЕКТЫ ИОНОВ СЕРЕБРА
II. 2.1. Механизмы действия ионов серебра
II. 2.2. Резистентность к ионам серебра
11.3. ДЕЙСТВИЕ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА
II. 3.1. Механизмы действия НЧС
11.4. ИНГИБИРОВАНИЕ НАНОЧАСТИЦАМИ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИ
ОБЛУЧЕНИИ СВЕТОМ
II. 4.1. Фотокаталитический механизм
II. 4.2. Фототермальный эффект
11.5. СИНТЕЗ НАНОЧАСТИЦ
II.5.1. Биосинтез наночастиц с использованием бактерий
11.6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
III. 1. Среды и условия культивирования бактерий E.coli, Pseudomonas, Serratia
111.2. Штаммы, плазмиды и олигонуклеотиды
111.3. Используемые наночастицы серебра, ионы серебра и золота
111.4. Определение минимальных ингибирующих концентраций (МИК)
111.5. Кинетика роста Е. coli АВ1157 в присутствии наночастиц серебра
111.6. Определение образования биопленок
111.7. Влияние соединений серебра и золота на деградацию зрелых биопленок
111.8. Определение живых и мертвых клеток в составе биопленок
111.9. Влияние соединений серебра и золота на выживаемость клеток бактерий в стационарной и логарифмической фазах роста, а также в аэробных и анаэробных условиях роста
III. 10. Передача плазмид рМЕ6863 и рМЕбООО
III. 11. ПЦР — амплификация
III. 12. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле
III. 13. Определение продукции АГЛ
111.14. Условия получения наночастиц золота для оптоперфорации клеточной стенки Anabaena sp.PCC 7120
111.15. Оптоперфорация клеточной стенки цианобактерий и биопленок
бактерий Е
111.16. Биогенез наночастиц серебра и золота
III.17. Спектрофотометрия суспензии клеток с наночастицами серебра и золота
III. 18. Электронная микроскопия
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ
IV. 1. Изучение действия ионов и наночастиц серебра на клетки бактерий
IV. 1.1. Влияние ионов и наночастиц серебра на рост бактерий
IV. 1.2. Действие ионов и наночастиц серебра на формирование биопленок
бактериями
IV. 1.3. Влияние НЧС на деградацию биопленок бактерий и гибель клеток в них
IV. 1.4. Изучение механизмов повышенной резистентности биопленок E.coli к
действию ионов и наночастиц серебра
ГУ. 1.5. Чувствительность к серебру клеток E. coli с мутациями в генах, участвующих в репарации ДНК, глобальной регуляции экспрессии генов
бактерий, синтезе транспортных белков портов
ГУ. 1.6. Quorum Sensing регуляция и действие ионов и наночастиц серебра на
бактерии
IV.2. Изучение действия ионов и наночастиц золота на клетки бактерий
IV.2.1. Влияние ионов золота на рост бактерий
IV.2.2. Действие ионов золота на формирование биопленок бактериями
ГУ. 2.3. Влияние ионов золота на деградацию биопленок бактерий и гибель клеток
в та
IV.2.4. Изучение механизмов повышенной резистентности биопленок E.coli к
действию ионов золота
IV.2.5. Чувствительность к ионам золота клеток E. coli с мутациями в генах, участвующга в глобальной регуляции экспрессии генов бактерий, репарации
ДНК, синтезе транспортных белков поринов
IV.2.6. Влияние наночастиц золота на рост бактерий
IV.3. Фемтосекундная оптоперфорация стенки цианобактерий Anabaena sp. РСС 7120
wt в присутствии наночастиц золота
IV.4. Разработка метода разрушения биопленок с помощью лазерного облучения
наночастиц золота
IV.5. Получение наночастиц металлов биологическими способами
V. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
VI. ВЫВОДЫ
VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
VIII. БЛАГОДАРНОСТИ

*v' ЛГ*5
I. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
В последние годы все увеличивающееся внимание исследователей привлекают вопросы, связанные с биомедицинским использованием наночастиц металлов. Это объясняется, прежде всего, насущной необходимостью разработки принципиально новых лекарственных препаратов против инфекций микроорганизмов, что обусловлено широким распространением форм патогенных бактерий - возбудителей различных острых и хронических инфекций, устойчивых к антибиотикам и другим антибактериальным средствам. Кроме того, существенные перспективы может дать в будущем применение лекарственных средств на основе наноматериалов в онкологии и многих других важных областях медицины. Основой этого послужили значимые успехи, достигнутые в разработке методов получения наночастиц металлов различной формы и размера, нанокомпозитов и покрытий устройств медицинского назначения. Активно проводятся исследования перспектив использования наночастиц (1ГЧ) с адресной доставкой лекарств для антираковой терапии, конструируемых на основе магнитных наночастиц и наночастиц золота, активируемых светом, что обуславливает их фототермальный эффект.
Наиболее изученными и используемыми в биомедицинских исследованиях являются наноматериалы на основе серебра. Соединения серебра проявляют высокую токсичность по отношению к широкому ряду микроорганизмов, и в силу этого они эффективно применяются в медицине против разнообразных инфекций, в том числе в виде наночастиц, покрытий различных имплантируемых устройств, дезинфицирующих фильтров и т.п. Несмотря на то, что бактерицидные свойства соединений серебра хорошо известны и давно используются человеком, биохимические механизмы их действия изучены лишь частично.
В настоящее время развернут широкий фронт исследований наночастиц металлов и полупроводников, их действия на микроорганизмы и другие живые клетки, а также перспектив их использования в биомедицине.
Большую проблему для медицины представляет способность патогенных бактерий формировать биопленки - сообщества бактерий, прикрепленные к различным поверхностям и окруженные матриксом, состоящим из внеклеточных полисахаридов, белков, нуклеиновых кислот и др. Устойчивость бактерий, обитающих в биопленках, к лекарственным препаратам многократно повышена по сравнению с планктонно

«1,лЩ*ЙДРИ
Известно, что механизмы резистентности к серебру включают наличие трех-полипептидного мембранного катион-протонного антнпортера Sil СВА и белка SilP, являющегося мембранным насосом, зависимым от АТФ-азы. Эти белки выводят соединения серебра из цитоплазмы в периплазматическое пространство. Механизм резистентности также включает участие маленького периплазматического белка SilE, который связывается с ионами серебра на поверхности клеток (Li, Nikaido et al. 1997; Gupta and Silver 1998). У P. stützen был выделен периплазматический белок, который может связываться с ионами серебра и восстанавливать их, тем самым вызывая преципитацию НЧС. Было обнаружено, что данный пептид длиной 7-14 аминокислотных остатков сходен по строению с белком SilE. Кроме того, в периплазматической мембране был обнаружен сульфид серебра Ag2S, который может образовываться в реакции AgNC>3 с сероводородом IKS; последний выделяется штаммом P. stutzeri (Slawson, Trevors et al. 1992).
Штамм бактерий Morganella sp., принадлежащий к семейству Enterobacteriaceae, при добавлении к нему 5 мМ раствора AgNCb образует стабильные сферические наночастицы серебра размером ~ 20 нм (Parikh, Singh et al. 2008). Было показано, что данный штамм содержит все три описанных выше системы, определяющие резистентность к серебру, и является крайне устойчивым к действию ионов Ag+. Ранее сообщалось, что периплазматический катион-связывающий белок специфично взаимодействует с ионами Ag+ (Gupta, Matsui et al. 1999). Следует отметить, что описанный штамм бактерий не образует наночастиц золота при добавлении в среду ионов Аи3+, что говорит о специфичности связывания белка SilP с ионами Ag+. Другие представители семейства Enterobacteriaceae, такие как Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae и Serratia marcescens, а также близкие таксономические группы бактерий Firmicutes nActinobacter, не образовывали НЧС (все перечисленные бактерии не обладали системой резистентности к металлам). Авторы предполагают, что механизм биосинтеза НЧС может быть тесно связан с системой резистентности клетки к серебру.
Было показано, однако, что супернатанты штаммов Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli и Enterobacter cloacae эффективно образовывали НЧС при культивировании их с раствором нитрата серебра на свету (видимое излучение; образование НЧС при постановке опыта в темноте не наблюдалось) (Minaeian, Shahverdi et al. 2008; Mokhtari, Daneshpajouh et al. 2009). Полученные растворы НЧС были крайне стабильны и содержали частицы серебра размером 50-100 нм. Таким образом, освещение является важным фактором получения НЧС у перечисленных штаммов бактерий, так как