Влияние экспрессии гетерологичных генов хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов в трансгенных растениях томата (Solanum lycopersicum L.) на повышение их устойчивости к фитопатогенам

• Автор: Халилуев, Марат Рушанович
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 133 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

6-БАП - 6-бензиламинопурин ИМК - 3-индолилмасляная кислота 2-іР - 2-изопентениладенин НУК - 1- нафтилуксусная кислота ИУК - 3-индолилуксусная кислота

ТДЗ — тидиазурон (3-(1,2,3-Тиадиазолин-5)-1-фенилмочевина)

ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота

MS - среда Мурасиге-Скуга

LB - среда Лурия-Бертани

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота

АФК - активные формы кислорода

СПУ - реакция системной приобретенной устойчивости СВЧ - реакция сверхчувствительности АМП - антимикробные пептиды ПЦР - полимеразная цепная реакция

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция со стадией обратной транскрипции

PR-белки - белки, связанные с патогенезом (pathogenesis-related protein)
gus - ген бета-глюкуронидазы
nptll— ген неомицинфосфотрансферазы II
gfp - ген зеленого флуоресцирующего белка (green fluorescence protein)
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Культура томата в условиях in vitro
1.2. Факторы, влияющие на процесс органогенеза побегов томата
1.2.1. Генетические факторы
1.2.2. Химические факторы
1.2.3. Физические факторы
1.3. Генетическая трансформация томата
1.3.1. Методы генетической трансформации
1.3.2. Факторы, влияющие на эффективность агробактериальной ] g трансформации
1.4. Молекулярно-генетические механизмы устойчивости растений 23 к патогенам
1.5. Классификация и характеристика PR-белков растений
1.5.1. Хитинсвязывающие белки (PR-4)
1.6. Классификация и характеристика растительных антимикробных 3 j пептидов
1.7. Стратегии повышения устойчивости томата к грибным и 34 бактериальным патогенам методами генной инженерии
1.7.1. Использование генов катионных пептидных антибиотиков
1.7.2. Экспрессия генов, кодирующих фитоалексины
1.7.3. Использование генов устойчивости (R-генов)
1.7.4. Ингибирование токсичных продуктов патогена
1.7.5. Изменение структурных компонентов клеточной стенки
1.7.6. Активация защитных реакций растения
1.7.7. Использование PR-белков и антимикробных пептидов 43 растений
1.8. Заключение по обзору литературы

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2 Л. Растительный материал
2.2. Введение томата в культуру in vitro
2.3. Регенерация побегов томата
2.4. Штаммы Agrobacterium tumefaciens и бинарные векторы
2.5. Агробактериальная трансформация томата
2.6. Молекулярно-генетический анализ трансгенных растений 5g томатов
2.6.1. Выделение тотальной геномной ДНК
2.6.2. ПЦР-анализ трансгенных растений
2.6.3. Анализ экспрессии генов методом ОТ-ПЦР
2.6.4. Электрофорез продуктов амплификации в агарозном геле
2.7. Флуориметрический анализ активности GFP
2.8. Мультипликация трансгенных регенерантов и их адаптация к gg условиям in vivo
2.9. Лабораторная оценка устойчивости трансгенных растений томата g ] к Phytophthora infestans (Mont.) de Вагу
2.10. Наследование селективного гена в поколении Ті томата
2.11. Статистическая обработка результатов эксперимента
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Агробактериальная трансформация томата селекционной линии
ЯЛФ бинарными векторами, содержащими гены
хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов
3.1.1. Трансформация и отбор устойчивых к селективному агенту g3 регенерантов.
3.1.2. Подтверждение трансгенной природы регенерантов методом g7 ПЦР-анализа
3.1.3. Анализ экспрессии генов хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов методом ^ ОТ-ПЦР

1.7.1 Использование генов катионных пептидных антибиотиков.
Для передачи растениям томата устойчивости к патогенным бактериям и грибам оказалось перспективным использование различных генов катионных пептидных антибиотиков, в частности, магаининов и цекропинов. В исследовании Alan с соавторами (2004) методом агробактериальной трансформации получены растения томата с геном MSI-99, который является синтетическим аналогом магаинина II — антимикробного пептида, выделенного из кожи африканской шпорцевой лягушки Xenopus laevis (Zasloff, 1987). В результате тестирования растений на устойчивость к Pseudomonas syringae pv. tomato было установлено, что степень проявления симптомов развития болезни у некоторых линий, экспрессирующих ген катионного пептида, была значительно меньше, чем у контрольного образца. Однако они оказались восприимчивы к Altemaria solani и Phytophthora infestans.
Векторная конструкции pBI121-spCß, смысловой частью экспрессионной кассеты которой является природный ген цекропина В, выделенный из гигантского шелкопряда Hyalophora cecropia (Hultmark et al., 1982), с сигнальной последовательностью гена а-амилазы ячменя, была использована для получения трангенных растений томата сорта Microtom, устойчивых к бактериальному патогену Ralstonia solanacearum. Кроме того, при инокуляции Xanthomonas campestris pv vesicatoria количество бактериальных пятен на листьях трансгенных растениях было на 74% ниже по сравнению с контролем (Jan et al., 2010).
1.7.2 Экспрессия генов, кодирующих фитоалексины.
Для повышения устойчивости томата к фитопатогенам большой интерес
представляет стратегия метаболической инженерии с использованием генов,
кодирующих фитоалексины - защитные низкомолекулярные соединения,
индуцируемые при воздействии патогенных микроорганизмов и элиситоров
(Hammerschmidt, 1999; Grayer and Kokubun, 2001). Так, в растения томата