Разработка эффективной системы регенерации подсолнечника (Helianthus annuus L.) in vitro для получения трансгенных растений

• Автор: Нескородов, Ярослав Борисович
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 168 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ИЛЛЮСТРАЦИЙ И ТАБЛИЦ

ВВЕДЕНИЕ

I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Краткая история культуры подсолнечника и его систематическое положение

1.2 Этапы генетической модификации подсолнечника

1.2.1 Выбор генотипа подсолнечника для последующей работы

1.2.2 Получение асептического растительного материала

1.2.3 Культивирование оксплантов подсолнечника в условиях in vitro

1.2.4 Генетическая трансформация подсолнечника
1.2.5 Канампцин как селективный агент
1.2.6 Фосфинотрицин как селективный агент
1.3 Некоторые направления биотехнологии подсолнечника в мире
1.3.1 Подсолнечник, устойчивый к абиотическим стрессам
1.3.2 Подсолнечник, как продуцент
II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.4 Использ о ванные генотипы подсолнечника
2.5 Получение асептического растительного материала
2.5.1 Способ стерилизации №
2.5.2 Способ стерилизации №
2.5.3 Определение качества семян подсолнечника
2.6 Условия культивирования растений iп vitro
2.6.1 Состав питательных сред для культивирования растений
2.6.2 Состав питательных сред для культивирования бактерий
2.6.3 Способ получения эксплантов для регенерации №
2.6.4 Способ получения эксплантов для регенерации №
2.7 Процедура генетической трансформации эксплантов подсолнечника
2.7.1 Определение летальной концентрации РРТ для подсолнечника in vitro.
2.7.2 Использованные антибиотики
2.7.3 Селективный отбор трансформантов
2.7.4 Метод прививки и адаптация растеиий-регенерантов к условиям теплицы.

2.7.5 Отбор растений, устойчивых к действию гербицида
2.7.6 Определение уровня устойчивости траисгенных растений к действию
фисфинотрицина
2.8 Молекулярно-генетический анализ трансгенных растений
2.8.1 Параметры ПЦР-анализа гена bar
2.8.2 Параметры ПЦР-анализа vz'r-генов Agrobacterium tumefaciens
2.8.3 Параметры блот-гибридизации
2.8.4 Определение экспрессии гена bar
2.8.5 Определение компетентности эксплантов к заражению A. tumefaciens.
2.8.6 Электорофоретическин анализ
2.9 Статистическая обработка данных
2.9.1 Дисперсионный анализ
2.9.2 Наименьшая существенная разница
2.10 Бактериальные штаммы и плазмиды

2.11 Микроскопы и другое оборудование
III РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Получение стерильного растительного материала
3.2 Экспресс-метод оценки жизнеспособности семян подсолнечника
3.3 Влияние типа экспланта и генотипа на частоту регенерации побегов in vitro
3.3.1 Способ получения эксплантов №
3.3.2 Способ получения эксплантов №
3.3.3 Сравнение эффективности 2-х способов
3.4 Генетическая трансформация эксплантов, полученных способом №2.
3.4.1 Индукция множественного побегообразования
3.4.2 Регенерация экспланта и его генетическая трансформация
3.5 Получение канамицин-устойчивых ГМ растений подсолнечника
3.6 Получение фосфинотрицин-устойчивых ГМ растений подсолнечника
IV ВЫВОДЫ
V Приложение
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
цМ микромоль
2,4-D 2,4 - дихлорфсноксиуксусная кислота
В5 питательная среда Гамбурга и др. [15 8]
bar ген, кодирующий фосфинотрицин-ацетил-трансферазу
СЬ Динатриевая соль карбенициллина
Cf Цефотаксима натриевая соль
GFP зеленый флюоресцирующий белок (green fluorescent protein)
GUS /Ттлюкуронидаза (/^glucuronidase)
NplII ген, кодирующий неомицинфосфотрансферазу II
Km Сульфат канамицина
LB питательная среда Luria-Bertani
_ деионизированная вода, очищенная посредством фильтрации через
с фильтры Millipore Corporation.
MS питательная среда Мурасиге и Скуга (Murashige and Skoog)[72]
РРТ фосфинотрицин
Rf рифампицин
g Сименс — единица измерения электрической проводимости.
Величина обратная Ому.
UPOV The International Union for the New Varieties of Plant
v/r гены гены вирулентности агробакгерии
X-gluc 5-бром-4-хлор-3-индолил-(3-глюкурошщ
БАП (ВАР) 6-бензиламинопурин
ГК (GA) гиббереллиновая кислота
ГМ генетически модифицированный
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
ИМК (IBA) индолил-3-масляная кислота
ИУК (IAA) индолил-3—уксусная кислота
мМ миллимоль
Hg гигромицин
НУК (NAA) а-нафтилуксусная кислота
ПЦР полимеразная цепная реакция
РАТ фосфинотрицин-ацетил-трансфераза (ФАТ)
РРР регуляторы роста растений
CAT хлорамфеникол-ацетил трансфераза
Т.17.Н. тысяч пар нуклеотидов

которая продолжается с 1923, можно объяснить доступностью реактивов и простотой проведения процедур стерилизации, в которых, разные авторы, подвергли модификации такие параметры как концентрация стерилизующего агента и время экспозиции. В более поздних работах в качестве стерилизующего раствора используются коммерческие отбеливающие смеси, такие как «Domestos», «Chlorex» и т.п. в различной концентрации.
К сожалению, не все авторы указывают параметры стерилизации растительного материала в своих работах. Например, A.J. Riker и Alice E.Gutsche сообщили только то, что в работе использовали свободную от микроорганизмов растительную ткань [66]. Также, практически ни кто из авторов не указывает эффективность используемого ими метода стерилизации и другую, сопутствующую процессу, информацию.
1.2.3 Культивирование эксплантов подсолнечника в условиях in vitro
О некоторых особенностях культивирования подсолнечника in vitro уже упоминалось выше [на стр. 33], но в настоящей главе они будут рассмотрены более подробно.
Способность изолированных фрагментов растительной ткани, при культивировании на искусственных питательных средах, формировать побеги, является основой клонального микроразмножения, которое, в свою очередь, необходимо для проведения генетической трансформации. Для многих ценных сельскохозяйственных культур подобный способ размножения хорошо отработан и является рутинным, широко применяясь как в исследовательских, так и прикладных целях [67]. При данных процедурах чаще всего используют многоклеточные экспланты, которыми могут быть как высечками листьев, фрагменты гипокотилей, апикальные меристемами, а также зрелые и незрелые зародыши. Однако применение имеющихся протоколов индукции регенерации, эффективных на других