Совершенствование метода получения клонированных эмбрионов крупного рогатого скота при использовании в качестве доноров ядер соматических клеток

• Автор: Комиссаров, Андрей Владимирович
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: п. Родники
• Количество страниц: 173 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Современное состояние технологии трансплантации ядер

1.2. Клеточный цикл эукариот и его регуляция

1.3. Культивирование и криоконсервация соматических клеток

1.4. Развитие и созревание яйцеклетки

1.5. Дозревание ооцитов in vitro

1.6. Энуклеация ооцитов

1.7. Репрограммирование трансплантированного ядра соматической клетки

1.8. Влияние фазы клеточного цикла клетки-донора ядра на эффективность клонирования
1.9. Подготовка клеток-доноров ядер к трансплантации
1.10. Значение продолжительности пребывания ядра соматической клетки в неактивированной цитоплазме
1.11. Активирование реконструированных эмбрионов
1.12. Культивирование эмбрионов млекопитающих in vitro
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.2.1. Дозревание in vitro ооцитов крупного рогатого скота и свиней
2.2.2. Эффективность «слепой» энуклеации ооцитов крупного рогатого скота и свиней без zona pellucida
2.2.3. Получение и криоконсервация линий фетальных фибробластов и фибробластоподобных клеток кожи взрослого животного
2.2.4. Получение фетальных фибробластов крупного рогатого скота в G1 фазе клеточного цикла

2.2.5. Подготовка пар цитопласт-соматическая клетка к электрослиянию
2.2.6. Воздействие электроимпульса на ооциты крупного рогатого скота в
зависимости от наличия кальция в среде
2.2.7. Изучение эффективности электрослияния пар цитопласт-соматическая клетка в среде без кальция
2.2.8. Активирование реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота без zona pellucida химическим методом
2.2.9. Приготовление питательных сред и метод культивирования реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота без zona pellucida
2.2.10. Использование криоконсервированных соматических клеток в качестве доноров ядер сразу после оттаивания и после дополнительного
культивирования
2.2.11. Влияние длительности пребывания ядра соматической клетки в неактивированном цитопласте на эффективность развития реконструированных эмбрионов in vitro
3. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
4. ВЫВОДЫ
5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ
7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ПРИЛОЖЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Научные разработки в области клонирования животных имеют как фундаментальное, так и прикладное значение. С помощью метода клонирования можно получить ответы на некоторые фундаментальные вопросы биологии развития, ядерно-цитоплазматического взаимодействия, репрограммирования ядра. Путем клонирования можно увеличить поголовье животных с высоким генетическим потенциалом, в частности, элитных быков-нроизводителей (Wilmut et al., 2000), а так же решить проблему сохранения видов животных, находящихся под угрозой исчезновения, и даже восстановления уже исчезнувших (Lanza et al., 2000; Loi et al., 2001). Метод клонирования позволяет существенно увеличить эффективность получения трансгенных животных, что особенно важно в отношении крупного рогатого скота и свиней (Polejaeva, Campbell, 2000; McCreath et al., 2000; Melo et al., 2005). Идея клонирования воплощена в методе переноса ядра (nuclear transfer, NT) клетки-донора в энуклеированную неоплодотворенную яйцеклетку, находящуюся в метафазе второго деления мейоза (Wilmut et al., 1997). Изначально источниками ядер для подобных исследований служили бластомеры (Willadsen, 1986). В настоящее время достигнуты успехи при переносе ядер соматических клеток (somatic cell nuclear transfer, SCNT) при клонировании овец (Wilmut et al., 1997), крупного рогатого скота (Cibelli et al, 1998; Kato et al, 1998), мышей (Wakayama et al., 1998), коз (Baguisi et al., 1999), свиней (Betthauser et al., 2000; Polejaeva et al., 2000), кроликов (Chesne et al., 2002), лошадей (Galli et al, 2003), крыс (Zhou et al., 2003) и других видов. Сущность технологии SCNT заключается в том, что в предварительно энуклеированную яйцеклетку (цитопласт) вводится ядро соматической клетки. Классическая технология получения клонированных животных, предложенная 25 лет назад (Willadsen, 1986) и применяемая до настоящего времени, остается сложной. Альтернативой

1.11. Активирование реконструированных эмбрионов
Высвобождение связанного кальция вызывает инозитол-1,4,5-трисфосфат (ИТФ), который синтезируется в ответ на прикрепление спермия к плазматической мембране яйцеклетки (Berridge, 1985; Swann, Whitaker, 1986).
Мейоз ооцитов большинства видов млекопитающих перед овуляцией ингибируется на стадии МП за счет высокой активности MPF в зрелых ооцитах. Оплодотворение позволяет ооцитам завершить второе деление мейоза и вместе с последовательными сериями активации и инактивации MPF, определяющими прохождение клеток через повторяющиеся митотические деления, запускает процесс развития эмбриона (Ford, 1985; Kirschner et al., 1985; Maller, 1985; Lohka et al., 1988; Cyert, Kürschner, 1988).
После проникновения спермия в яйцеклетку происходят повышение внутриклеточного pH, циклические возрастания концентрации внутриклеточного кальция, экзоцитоз кортикальных гранул (Epel, 1990). Из всех реакций яйцеклетки на проникновение спермия именно подъем концентрации внутриклеточного кальция считается тем условием, которое активирует каскад клеточных изменений, необходимых для завершения мейоза (Jaffe, 1983).
Подъем концентрации внутриклеточного кальция ингибирует дефосфорилирование CDK2, что, в свою очередь, снижает активность MPF и активирует ооциты (Shen et al., 2008).
Дальнейшая реакция ооцитов крупного рогатого скота на подъем концентрации внутриклеточного кальция зависит от их возраста. Завершение мейоза и выделение перевого полярного тельца (Polar Body I, РВІ) происходило у дозревших in vitro ооцитов в возрасте 24' ч от начала дозревания на уровне 66-88% (Susko-Parrish et al., 1994; Soloy et al., 1997; Liu