Адвентивное почкообразование и каллусогенез у сибирских видов хвойных в культуре in vitro

• Автор: Филиппова, Ирина Панфиловна
• Шифр специальности: 03.01.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Красноярск
• Количество страниц: 145 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Компоненты питательных сред
1.2. Каллусные культуры
1.3 .Адвентивное почкообразование у хвойных в культуре in vitro
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования
ГЛАВА 3. Каллусные культуры ели сибирской, сосны обыкновенной и
лиственницы сибирской
ГЛАВА 4. Адвентивное почкообразование у ели сибирской, лиственницы сибирской и сосны обыкновенной и гистологический контроль эксплантов видов хвойных на средах с цитокининами
4.1. Адвентивное почкообразование
4.1.1. Экспланты - почки деревьев
4.1.2. Экспланты - зрелые зиготические зародыши
4.2. Гистологический анализ эксплантов (зрелых зиготических зародышей) растущих на среде с 6-БАП
4.2.1. Гистологический анализ эксплантов ели сибирской (0-35 суток
in vitro) культивируемых на средах Vi MS-0 и Vi MS+6-БАП
4.2.2. Дифференцирование трахеид в эксплантах исследуемых видов хвойных на ранних сроках культуры in vitro
4.2.3. Гистологический анализ эксплантов ели сибирской культивируемых 60 суток в культуре in vitro
4.2.4. Гистологический анализ адвентивного почкообразования у эксплантов лиственницы сибирской и сосны обыкновенной
4.2.5. Гистологический анализ адвентивных растений
ГЛАВА 5. Адвентивное почкообразование у эксплантов видов хвойных с использованием импульсной обработки цитокинином
5.1. Экспланты - зрелые зиготические зародыши хвойных
5.2. Экспланты - семядоли проростков семян хвойных
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА
ВВЕДЕНИЕ
Термин "культура тканей растений" охватывает многие типы стерильно выращиваемых культур. Это каллусные культуры, культуры изолированных меристем, зародышей, пыльников, корней, суспензионные культуры клеток и тканей. Методы in vitro позволяют создавать в строго контролируемых условиях модельные системы, что облегчает возможность слежения за изменениями строения и физиологии растительных объектов. В культуре изолированных тканей и клеток отчетливо появляется свойство тотипотентности растительной клетки, в основе которого лежит реализация различной наследственной информации в конкретных условиях, складывающихся в клетке под влиянием внешних и внутренних факторов (Бутенко, 1964).
Методы культуры растений in vitro находят все большее применение в фундаментальных и прикладных исследованиях в области физиологии, генетики, эмбриологии растений и целом в биологии развития растений. Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально новых методов вегетативного размножения, таких как микрочеренкование, адвентивное почкообразование и соматический эмбриогенез (Биотехнология растений, 1989). Использование этих методов, разработанных на покрытосеменных растениях, представляет значительный интерес для микроклонального размножения хвойных видов.
Культура тканей хвойных in vitro может играть важную роль в генетико-селекционных программах лесовосстановления древесных видов, так как репродуктивный потенциал этих видов снижается (Третьякова, Бажина, 1996). Однако, в исследованиях, которые проводятся с культурами in vitro органов, тканей и клеток растений одной из наиболее актуальных проблем является индукция морфогенеза. Особенно остро эта проблема стоит перед исследователями, работающими с древесными в том числе и хвойными растениями, поскольку известно, что морфогенетические процессы в условиях in vitro индуцируются у них с большим трудом, характеризуются

нестабильностью и трудной воспроизводимостью (Савельев и др., 2008). В то же время открытие у хвойных соматического эмбриогенеза (Hakman et al., 1985; Chalupa, 1985) и адвентивного почкообразования (Хмара, Катаева, 1993; Arnold, 1982; Lapp et al., 1995; Gonzales et al., 1998; Renau-Morata et al., 2005 и др.) в культуре in vitro свидетельствует о множественности реализации морфогенетических программ у данного класса растений в контролируемых условиях и способности хвойных видов к массовому размножению через методы культуры тканей.
Цель исследования: изучение закономерностей адвентивного
почкообразования и каллусогенеза у ели сибирской (Picea obovata Ledeb.), лиственницы сибирской {Larix sibirica Ledeb.) и сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) в культуре in vitro.
В задачи исследований входило:
-выбор эксплантов и подбор оптимальных условий культуры in vitro для каллусогенеза;
-установление оптимальных концентраций цитокининов в питательной среде для адвентивного почкообразования;
-проведение гистологического контроля на разных сроках культуры in vitro у эксплантов в условиях направленного органогенеза;
-оценка эффективности индуцирующего действия «импульсной» обработки эксплантов высокими концентрациями цитокинина (6-БАП) на образование адвентивных почек.
Научная новизна. Выявлены общие закономерности и специфические особенности культивирования эксплантов сибирских видов хвойных in vitro. Впервые проведен гистологический анализ образования адвентивных почек у зародышей ели сибирской, сосны обыкновенной и лиственницы сибирской. Впервые к эксплантам сибирских видов хвойных (зрелым зиготическим зародышам и семядольным хвоинкам проростков) была применена методика импульсной обработки высокими концентрациями цитокинина, в результате

образовавшийся в течение первого пассажа (28-30 суток), отделяли от экспланта и переносили для дальнейшего роста на свежую среду того же состава (второй пассаж). При следующей пересадке (через 28-30 суток роста) каллусы делили на части, удаляли коричневые участи и пересаживали на свежую среду. Период роста каллусов от пересадки до пересадки (пассаж) составлял во всех экспериментах 28-30 суток.
Интенсивность каллусообразования рассчитывали по формуле:
И(%) = Э,/Э2хЮ
где Э] — количество эксплантов образовавших каллус, Э2 - общее количество эксплантов в опыте.
Интенсивность прироста сырой биомассы в течении пассажа рассчитывали по формуле:
К = (М-МоУМо
где М - биомасса в конце пассажа, М0 - биомасса в начале пассажа (Perez-Frances et al., 1995; Nin et al., 1996).
Для определения состояния фотосинтетических мембран хлоропластов культур хвойных in vitro использовали метод термоиндуцированных изменений нулевого уровня флуоресценции хлорофилла (ТИНУФ), который представляет собой регистрацию флуоресценции в ходе плавного нагрева изолированных хлоропластов, клеток или высечек листьев растений (Гаевский и др., 1991; Нестеренко и др., 2001). Измерения проводили на индуктофлуориметре, разработанном на кафедре физиологии растений и микробиологии Красноярского государственного университета.
В качестве объектов использовали каллусные культуры и культуры с адвентивным почкообразованием лиственницы сибирской, ели сибирской и сосны обыкновенной, контролем служили проростки хвойных, растущие на среде без гормонов. Исследуемые образцы помещали в кювету прибора с отстоянной водой. Период темновой адаптации составлял 5 мин. Нагрев образцов проводили со скоростью 3,5 градус/мин в диапазоне 30-75° С.
Флуоресценцию хлорофилла возбуждали светом с Атшх 430 нм, длина волны