Влияние цитокининов и салициловой кислоты на экспрессию генов митохондриальных белков

• Автор: Белозерова, Наталья Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 152 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Глава 1. ВВЕДЕНИЕ
Глава 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Организация и функционирование митохондрий растений
2.1.1. Общие представления о структуре и функциях митохондрий растений
2.1.2. Пути переноса электронов в дыхательной цепи митохондрии
2.2. Организация митохондриального генома
2.2.1. Особенности организации генома митохондрий растений
2.2.2. Основные пути регуляции экспрессии митохондриальных генов растений
2.3. Альтернативная оксидаза
2.3.1. Структура и функция белка
2.3.2. Роль АО при воздействии на растение биотических и абиотических факторов
2.4. Роль фитогормонов в регуляции интенсивности дыхания растений
2.5. Характеристика люпина жёлтого (Ьиртш Шет Ь.) как модельного объекта исследования
Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Материалы и объекты, используемые в работе
3.2. Определение скорости дыхания в семядолях Ьиртия 1гйеи$
3.2.1. Анализ и обработка данных полярограммы
3.3. Выделение митохондрий методом дифференциального центрифугирования
3.3.1. Очистка митохондрий в сахарозном градиенте
3.3.2. Фракционирование митохондрий
3.4. Бактериальные штаммы
3.5. Клонирование фрагментов ДНК в вектор рТ257К/Т
3.5.1. Подбор праймеров к гену исследования
3.5.2. Биоинформационный анализ подобранных зондов для генов
3.6. Выделение тотальной растительной ДНК
3.7. Выделение митохондриальной ДНК
3.8. Выделение плазмидной ДНК E. coli
3.8.1. Микровыделение плазмидной ДНК
3.8.2. Макровыделение плазмидной ДНК
3.9. Определение количества и оценка качества препаратов нуклеиновых кислот
ЗЛО. Полимеразная цепная реакция
3.11. Электрофорез ДНК в агарозном геле
3.12. Очистка фрагментов ДНК из геля
3.12.1. Очистка фрагментов ДНК из геля с помощью набора «Silica Bead DNA Gel Extraction Kit» фирмы Fermentas
3.12.2. Элюция фрагментов ДНК электрофоретическим методом
3.13. Лигирование ДНК
3.14. Приготовление компетентных клеток
3.14.1. Приготовление компетентных клеток согласно рекомендации фирмы fermentas
3.14.2. Приготовление компетентных клеток с использованием СаСЬ
3.15. Трансформация бактериальных клеток
3.16. Рестрикция ДНК
3.17. Секвенирование ДНК
3.18. Метод run-on транскрипции
3.18.1. Иммобилизация фрагментов ДНК на нейлоновую мембрану
3.18.2. Определение количества белка в препарате митохондрий
3.18.3. Синтез меченых транскриптов в лизате митохондрий
3.18.4. ДНК-РНК гибридизация
3.18.5. Оценка результатов гибридизации
3.19. ПЦР после обратной транскрипции
3.19.1. Выделение суммарной растительной РНК с помощью тризола
3.19.2. Электрофорез РНК в агарозном геле
3.19.3. Обратная транскрипция
3.19.4. ПЦР после обратной транскрипции
3.19.5. Анализ результатов
3.20. Вестерн-блоттинг
3.20.1. Выделение суммарного белка из митохондрий растений
3.20.2. Определение количества белка
3.20.2.1. Определение белка по Бредфорд
3.20.2.2. Определение белка бицинхонином
3.20.3. Разделение белков с помощью гель-электрофореза в денатурирующих условиях
3.20.4. Окраска белковых гелей
3.20.5. Перенос белков на мембрану
3.20.6. Иммунохимический анализ
3.21. Биоинформационный анализ
3.22. Статисический анализ
Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Влияние СК и 6-БАП на интенсивность дыхания в тканях семядолей люпина желтого
4.1.1. Оптимизация постановки эксперимента
4.1.2. Влияние СК на физиологические показатели дыхания в тканях этиолированных семядолях Lupinus luteus
4.1.3. Влияние 6-бензиламинопурина на показатели дыхания в тканях этиолированных семядолей Lupinus luteus
4.2. Изучение влияние 6-БАП и СК на интенсивность транскрипции митохондриальных генов
4.2.1. Клонирование фрагментов митохондриальных генов
4.2.2. Оптимизация выделения митохондрий для метода run-on транскрипции
4.2.3. Оптимизация метода run-on транскрипции
4.2.4. Влияние СК на интенсивность транскрипции митохондриальных генов
4.2.5. Влияние 6-БАП на интенсивность транскрипции митохондриальных генов
4.3. Влияние 6-БАП и СК на альтернативный путь переноса электронов у Lupinus luteus
4.3.1. Идентификация генов АО у Lupinus luteus

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
смерти, вызванной Н202, в то время как ингибиторы АО снижают эту устойчивость (Amor et al., 2000). По мнению некоторых авторов, активация АО может представлять важный механизм, предотвращающий запуск программированной клеточной смерти (Robson, Vanlerberghe, 2002; Vanlerberghe et al., 2002).
Кроме выше перечисленных функций; АО играет важную роль в поддержании ЦТК и гомеостаза растений. На последнее указывают работы, в которых показана индукция АО в мутантах, затрагивающих пластиды. Например, у мутантов albostrians Hordeum vulgare показано увеличение уровня митохондриальных транскриптов АО.
Известно также, что АО активируется в ответ на большое число различных типов неблагоприятных внешних воздействий: низкие и высокие температуры (Grabelnych et al., 2004), окислительный стресс (Polidoros et al., 2005), недостаток микроэлементов, в частности фосфата и азота (Sieger et al., 2005), различные инфекции (Lacomme,Roby, 1999), световой стресс, увеличение концентрации С02 и воздействие гербицидами (Gaston et al., 2003). При этом постулируется, что АО играет важную роль в - быстрой адаптации к стрессовым условиям. В настоящее время считается, что АО не только участвует в ответной реакции на стресс, но и играет важную роль в его идентификации. Однако, некоторые стрессы, например холод, не всегда индуцируют АО на каком-либо уровне.
Экспрессия генов АО изменяется при различных митохондриальных мутациях, в ответ на обработку ингибиторами ЭТЦ, в результате чего нарушаются митохондриальные функции, а также при воздействии гормонами.
АО кодируется у растений подсемействами двух ядерных генов, Аох! и Лох2, у однодольных и двудольных растений. Число представителей каждого подсемейства зависит от вида растения. Считается, что Аох1 гены экспрессируются в ответ на стресс и представлены у обоих классов. Представители Аох2 подсемейства представлены только у двудольных растений и обычно экспрессируются конститутивно. Например, у G. max выделен один ген Аох! и два Аох2а и Аох2Ь. Гены АО обладают высокой изменчивостью последовательностей,