Редокс-метаболизм каллусов гречихи, отличающихся по морфогенной способности

• Автор: Сибгатуллина, Гузель Валерьевна
• Шифр специальности: 03.01.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 142 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Морфогенез in vitro. Роль активных форм кислорода

1.2. Активные формы кислорода

1.3. Антиоксидантные системы

1.3.1. Антиоксидантные ферменты

1.3.2. Неферментативные антиоксидантные системы

1.4. Сигнальная функция активных форм кислорода

1.5. Потеря регенерационной способности и неопластическая трансформация в культурах клеток in vitro
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Объект исследования
2.2. Условия культивирования
2.3. Приготовление цитогенетических препаратов
2.4. Определение митотической активности
2.5. Определение активности растворимой псроксидазы
2.6. Определение активности аскорбатпероксидазы
2.7. Определение активности каталазы
2.8. Определение активности супероксиддисмутазы
2.9. Определение активности глутатионредуктазы
2.10. Определение содержания глутатиона
2.11. Определение суммы растворимых фенольных соединений
2.12. Определение антиоксидантної"! активности фенольных соединений
2.13. Определение содержания перекиси водорода
2.14. Определение уровня перекисного окисления липидов
2.15. Выявление локализации перекиси водорода с помощью хлорида церия
2.16. Определение сухой биомассы
2.17. Определение содержания белка
2.18. Определение жизнеспособности клеток
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Изменение морфо-цитогенетических и биохимических характеристик каллусов гречихи посевной при длительном культивировании
3.2. Сравнение морфо-цитогенетических характеристик клеток морфогенных и полученных из них неморфогеиных каллусов гречихи татарской
3.2.1. Содержание и локализация перекиси водорода и содержание малонового диальдегида в клетках каллусов гречихи татарской с различной морфогенной способностью
3.2.2. Активность антиоксидантных ферментов в -клетках морфогенных и неморфогенных каллусов гречихи татарской
3.3. Чувствительность морфогенного и неморфогенного каллусов гречихи татарской к действию ингибитора каталазы 3-амино-1,2,4-триазола
3.4. Характеристика морфогенного каллуса, полученного при действием АТ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность исследований. Устойчивость культивируемых клеток растений к окислительному стрессу может служить фактором, обуславливающим стабильность их регенерационного потенциала, поскольку работами последнего десятилетия показано, что редокс-статус играет существенную роль в регуляции морфогенеза растений (Siminis et al., 1994; Konieczny et al., 2008). Одним из связующих звеньев, определяющих участие окислительного стресса в регуляции процессов дифференцировки и морфогенеза у растений, является перекись водорода. Эта молекула играет роль вторичного посредника, вовлеченного в регуляцию экспрессии определенных генов, - имеющих в промоторах ARE (antioxidant responsive element) (Rushmore et al., 1991; Polidoros, Scandalios, 1999). Кроме того, мишенями перекиси водорода являются тиоловые группы цистеина, входящие в активные центры многих белков, в том числе участвующих в сигналлинге и контроле практически всех аспектов жизни, включая энергетический метаболизм, структуру цитоскелета, транспорт, пролиферацию, дифференциацию и программируемую клеточную смерть (Jones, 2008). Высказано предположение, что потеря регенерационной способности в каллусах и суспензиях при длительном культивировании может быть связана с негативным влиянием на генетический к аппарат клеток активных форм кислорода (АФК), повышенное' образование которых индуцируется условиями культивирования in vitro (Cassels, Curry, 2001; Gaspar et al., 1998). Как правило, неморфогенные, гормононезависимые, полностью потерявшие способность к образованию меристем каллусы имеют высокую оводненность, рыхлую структуру и большую по сравнению с морфогенными каллусами пролиферативную активность. Для них характерна генетическая нестабильность, выражающаяся в увеличении полиплоидных и анеуплоидных клеток. Подобные неморфогенные каллусы рассматриваются как опухолевые клетки растений (Матвеева и др., 2001). Gaspar et al. (2002) указывают, что повышенное содержание перекиси водорода в опухолевых клетках'как животных, так и растений может являться следствием аномального метаболизма, и в то же время необходимым фактором его поддержания. При изучении влияния

увеличивается и пролиферативная активность таких культур (Vasil, Vasil, 1981). Согласно Raghavan и Srivastava (1982) существует корреляция между скоростью роста клеток в культуре и их способностью к эмбриоидогенезу: медленно растущие культуры сохраняют их эмбриогенную способность намного дольше по сравнению с быстро растущими клеточными культурами. Изменения в морфологии каллусных культур, аналогичные наблюдаемым при длительном культивировании, можно вызвать, обрабатывая культуры химическими или физическими мутагенами (Moustafa et al., 1989; Persinger, Town, 1991).
При работе с культурами растительных клеток in vitro необходимо учитывать наличие сомаклональной изменчивости в этих условиях (Носов, 1999). Наблюдаемые изменения в культивируемых клетках объясняются в рамках теории «сомаклональной» вариабельности. В качестве одной из основных причин, индуцирующих генетическую изменчивость и потерю регенерационной активности в клетках при длительном культивировании, в ней рассматривают мутагенный эффект компонентов среды культивирования. Многие исследователи полагают, что механизм возникновения сомаклональной изменчивости сходен со спонтанными мутациями и вызывается АФК (Anonymous, 1995; Константинов, Ривкин, 1991; Micke, Donini, 1993).
Так, Benson (2000) выдвигает гипотезу, что процесс культивирования способствует изменению метаболизма и развития клеток, что может вызвать изменение редокс-баланса клеток. АФК, физические и химические агенты могут стимулировать перекисное окисление липидов, которое может привести к аутокислению, продуцирующему органические гидроперекиси. АФК, в присутствии ионов железа и меди, могут генерировать высоко мутагенные соединения: пероксильный и алкоксильный радикалы (Koh et al., 1997). Радикалы могут воздействовать на различные макромолекулы, и если поврежденные белки могут быть разрушены, то изменения в составе нуклеиновых кислот может быть закреплено в ходе репликации. Изменения в составе ДНК, индуцированные АФК, могут ингибировать метилирующие ферменты, что ведет к гипометилированию (Cerda, Weitzman, 1997; Wacksman, 1997). Под действием АФК может происходить