Структурно-функциональные закономерности воздействия амфифильных блок-сополимеров на раковые клетки

• Автор: Будкина, Ольга Александровна
• Шифр специальности: 02.00.06, 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 135 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Синтез и физико-химические свойства амфифильных
блок-сополимеров
1.1.1. Плюроники
1.1.2. Полиглицерины
1.1.3. Сополимеры на основе полидиметилсилоксана
1.1.4. Взаимодействие амфифильных блок-сополимеров с модельными липидными мембранами и особенности структуры клеточных мембран
1.2. Множественная лекарственная устойчивость раковых клеток и ее преодоление с помощью плюроников
1.2.1. Влияние плюроников на устойчивость раковых клеток к
лекарствам
1.2.2. Предполагаемые механизмы подавления активности Р-гликопротеина плюрониками
1.3. Токсичность плюроников
1.4. Защитная роль плюроников
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1.Ма1ериал ы
2.2.Методы исследования
2.2.1. Определение молекулярно-массовых характеристик полимеров
2.2.2. Определение ККМ с помощью флюоресцентного зонда
2.2.3. Определение ККМ методом статического светорассеяния
2.2.4. Культивирование клеток
2.2.5. Определение цитотоксичности доксорубицина и полимеров
2.2.6. Влияние полимеров на цитотоксичность доксорубицина
2.2.7. Анализ накопления БОХ в клетках
2.2.8. Получение меченных тритием полимеров
2.2.9. Радиоавтография
2.2.10. Получение конъюгата плюроника Ь61 с флуоресцеинизотиоцианатом

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Характеристика исследованных соединений
3.1.1. Структура
3.1.2. Расчет гидрофильно-липофильного баланса
3.1.3. Критическая концентрация мицеллообразования
3.2. Цитотоксичность исследованных соединений
3.2.1. Определение цитотоксичности: обоснование метода
3.2.2. Токсичность доксорубицина для клеток МСЕ7/Я
3.2.3. Цитотоксичность исследованных соединений
3.2.4. Сопоставление цитотоксичности и мицеллообразования исследованных соединений
3.3. Увеличение жизнеспособности клеток под действием ПЭО-содержатцих блок-сополимеров
3.4. Влияние исследованных соединений на устойчивость раковых клеток к доксорубицину
3.4.1. Влияние плюроника Ь61 на чувствительность раковых клеток к доксорубицину
3.4.2. Определение минимальной концентрации соединения, достаточной для подавления лекарственной устойчивости
3.4.3. Зависимость степени подавления лекарственной устойчивости от концентрации исследованного соединения
3.4.4.Особенности действия некоторых блок-сополимеров на лекарственную устойчивость раковых клеток
3.4.5.Предполагаемый механизм подавления лекарственной устойчивости раковых клеток
3.5. Исследование локализации рассматриваемых соединений при их взаимодействии с клетками
3.5.1. Получение ИТС-меченых блок-сополимеров
3.5.2. Влияние присоединенного Е1ТС на свойства блок-сополимеров
3.5.3. Исследование локализации блок-сополимеров флуоресцентным методом
3.5.4. Исследование локализации методом радиоавтографии
Заключение
Выводы
Список цитированной литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ГЛБ - гидрофильно-липофильный баланс ГПХ - гель-проникающая хроматография ДМС - диметилсилоксан ДМСО - диметилсульфоксид ДФГТ - дифенилгексатриен
ККМ - критическая концентрация мицеллообразования
КМП - минимальная концентрация полимера, при которой прирост клеток максимален
ННК - наибольшая нетоксичная концентрация
ПАВ - поверхностно-активное вещество
ПДМС - полидиметилсилоксан
ПО - пропиленоксид
ППО - полипропиленоксид
ПЭГ - полиэтиленгликоль
ПЭО - полиэтиленоксид
ТГФ - тетрагидрофуран
ТНБС - тринитробензолсульфокислота
ЭО - этиленоксид
ЭКМЛУ - минимальная концентрация полимера, достаточная для максимального подавления множественной лекарственной устойчивости раковых клеток
DAPI - флуоресцентный краситель, 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle's Medium - среда для культивирования клеток
DOX - доксорубицин
FITC - изотиоцианат флуоресцеина
G - глицерин
МЛУ - множественная лекарственная устойчивость
MRA - micoplasma removing agent, препарат от микоплазмы
МТТ - 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолий бромид
PBS - phosphate-buffered saline - буфер (10 мМ фосфата и 145 мМ NaCl, pH 7,4)
PG - полиглицерин P-gp - Р-гликопротеин
REP - (Radical, Ethylene oxide, Propylene oxide) двублочный сополимер ЭО и ПО
1С$о -концентрация полимера, вызывающая гибель 50% клеток
1C«* - концентрация доксорубицина, вызывающая гибель 50% клеток

основывалась на определении уровня креатинфосфокиназы в крови после инъекции сополимера. Увеличение концентрации данного фермента в крови пропорционально степени повреждения мышечных тканей. Тестирование ряда плюроников (Б88, Е127, Р105 и Р123) показало, что, чем гидрофобнее плюроник, тем сильнее было повреждение мышц и тем выше был уровень креатинфосфокиназы в крови. Так, плюроники Р105 и Р123, обладающие средними значениями ГЛБ, были признаны токсичными, тогда как гидрофильные плюроники (Р127 и Р88) по своей токсичности были сопоставимы с изотоническим раствором, Кремафором ЕЬ и арахисовым маслом. Изучение этого вопроса привело исследователей к важному выводу: чем гидрофильнее сополимер, тем ниже его токсичность [174].
Этот вывод подтвердился в трех работах при анализе токсичности плюроников для клеток в культуре (цитотоксичность), где на одних и тех же клеточных линиях в одинаковых условиях тестировали разные полимеры. Так, в работе [167] на трех линиях клеток была исследована цитотоксичность трех плюроников, различающихся по гидрофобности — П27 (ГЛБ=25), Р85 (ГЛБ=16) и Ь61 (ГЛБ=2-3). Показано, что наиболее гидрофильный плюроник П27 не был токсичен ни для одной из клеточных линий вплоть до концентрации 1%. Цитотоксичность плюроника Р85 была обнаружена при концентрации > 0,05%, а гидрофобный Ь61 оказался наиболее токсичным из трех полимеров и уже при концентрации 0,005% приводил к снижению количества клеток. Таким образом, чем гидрофобнее полимер, тем он токсичнее, и тем меньше его концентрация, при которой становится заметной гибель клеток (наибольшая нетоксичная концентрация, ННК). Тенденция снижения ННК по мере уменьшения гидрофильности полимера была также показана при сравнительном исследовании влияния плюроников Б127, 1.64 и 1.61 на выживаемость клеток линии Сасо-2. Плюроник Р127 не вызывал гибели клеток во всем диапазоне концентраций от 0,0005% до 1%, плюроник Ь64 оказался нетоксичным вплоть до 0,05 - 0,1%, а плюроник Б61 - до 0,01 - 0,05% [139].
Такое же закономерное изменение свойств характерно и для блок-сополимеров, содержащих в качестве гидрофобного блока не ППО, а полидиметилсилоксан [175]. Авторы синтезировали трехблочные сополимеры структуры ПЭО-ПДМС-ПЭО, содержавшие от 10 до 16 звеньев диметилсилоксана в гидрофобном блоке и от 4 до 44 звеньев этиленоксида в каждом гидрофильном блоке. Токсичность этих блок-сополимеров тестировали на первичной культуре фибробластов человеческой кожи. Наиболее токсичными оказались полимеры с короткими ПЭО блоками. Сополимеры на основе полидиметилсилоксана, содержавшие только 4-8 звеньев этиленоксида, в концентрации 0,1-1% подавляли рост клеток на 50-80%. В то же время гидрофильные блок-сополимеры с 44 звеньями ЭО были не токсичны во всем диапазоне тестированных концентраций от 0,001% до 1%.