Изоферменты изоцитратлиазы из амаранта: физико-химические свойства, регуляция, идентификация генов icl1 и icl2 и их экспрессия

• Автор: Сальников, Алексей Владимирович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 134 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Особенности метаболизма нетрадиционной культуры Амаранта

1.1.1 Морфо-физиологические и биохимические свойства амаранта

1.2. Глюконеогенез

1.2.1. Общая характеристика глюконеогенеза

1.2.2. Глюконеогенез в растениях

1.2.3. Глюконеогенез у животных

1.3. Глиоксилатный цикл

1.3.1. Роль глиоксилатного цикла

1.3.2. Распространение глиоксилатного цикла
1.3.2.1. Распространение глиоксилатного цикла у микроорганизмов, низших растений и грибов
1.3.2.2. Функционирование глиоксилатного цикла у высших растений
1.3.2.3. Глиоксилатный цикл в тканях животных
1.4. Субклеточная локализация изоцитратлиазы
1.5. Изоферментный состав изоцитратлиазы
1.6. Характеристика изоцитратлиазы
1.6.1. Выделение и очистка изоцитратлиазы из различных организмов
1.6.2. Молекулярная масса и субъединичное строение
1.6.3. Кинетика изоцитратлиазы
1.6.3.1. Константа Михаэлиса
1.6.3.2. Влияние ионов металлов на активность ИЦЛ
1.6.3.3. Синтазная реакция
1.6.3.4. Регуляция изоцитратлиазы
1.6.3.5. Оптимум pH изоцитратлиазы
1.6.4. Механизм действия изоцитратлиазы
1.6.5. Изоферменты

1.7. Молекулярные аспекты регуляции ИЦЛ
1.7.1. Экспрессионная регуляция изоцитратлиазы
1.7.2. Генетические механизмы регуляции синтеза ИЦЛ
1.7.3. Характеристика структурной организации генетического материала изоцитратлиазы
1.7.4. Эволюция ферментов глиоксилатного цикла
Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ
2.2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.2.1. Объекты исследования
2.2.2. Методы исследования
2.2.2.1. Определение активности изоцитратлиазы
2.2.2.2. Выделение и очистка фермента
2.2.2.3. Определение содержания белка
2.2.2.4. Электрофоретические исследования белков
2.2.2.4.1.Определение гомогенности ферментов
2.2.2.4.2. Специфическое проявление изоцитратлиазы
2.2.2.4.3. Определение молекулярной массы субъединиц ферментов
2.2.2.5.Субклеточная локализация
2.2.2.6. Определение молекулярной массы нативного фермента
2.2.2.7. Исследование кинетики и регуляции ИЦЛ
2.2.2.7.1. Определение константы Михаэлиса
2.2.2.7.2. Определение pH оптимума изоцитратлиазы
2.2.2.7.3. Регуляция ИЦЛ
2.2.2.8. Идентификация генов ісіі и іс12 и их экспрессия
2.2.2.8.1. Выделение суммарной клеточной популяции РНК
2.2.2.8.2. Проведение обратной транскрипции
2.2.2.8.3. Подбор праймеров
2.2.2.8.4. Проведение полимеразной цепной реакции

2.2.2.8.5. Секвенирование ПЦР-продукта
2.2.2.8.6. Проведение ПЦР в реальном времени
2.2.2.9. Статистическая обработка данных
2.3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
2.3.1.Динамика активности изоцитратлиазы
2.3.1.1. Динамика активности изоцитратлиазы в проростках амаранта
2.3.1.2. Динамика активности изоцитратлиазы в онтогенезе амаранта сорта «Рыжик»
2.3.2. Изоферментный состав ИЦЛ
2.3.2.1. Изоферментный состав ИЦЛ в проростках амаранта
2.3.2.2. Изоферментный состав ИЦЛ в стареющих листьях амаранта
2.3.3. Субклеточная локализация ИЦЛ
2.3.4. Очистка изоцитратлиазы из исследуемых объектов
2.3.4.1. Очистка изоцитратлиазы из проростков амаранта сорта «Кинельский»
2.3.4.2. Очистка изоцитратлиазы из проростков амаранта сорта «Рыжик»
2.3.4.3. Очистка изоцитратлиазы из стареющих листьев амаранта сорта «Рыжик»
2.3.5. Исследования на гомогенность и активность очищенных препаратов ИЦЛ
2.3.6. Молекулярная масса и субъединичное строение изоиитратлиазы
2.3.7. Кинетические свойства ИЦЛ
2.3.7.1. Определение константы Михаэлиса ИЦЛ из проростков амаранта сорта «Кинельский»
2.3.7.2. Определение константы Михаэлиса ИЦЛ из проростков амаранта сорта «Рыжик»

1.6. Характеристика изоцитратлиазы
1.6.1. Выделение и очистка изоцитратлиазы из различных организмов
Изоцитратлиаза (КФ 4.1.3.1; трео-03-изоцитрат-глиоксилат-лиаза) катализирует обратимую реакцию альдольного расщепления изоцитрата на глиоксилат и сукцинат. ИЦЛ высокоспецифичный фермент. ИЦЛ не только входит в глиоксилатный цикл, но и участвует (у высших растений) в образовании щавелевой кислоты, биосинтеза серина и глицина, а у микроорганизмов определяет способность расти на ацетате как единственном источнике углерода.
К настоящему времени ИЦЛ очищена до гомогенного состояния из многих видов микроорганизмов, в частности бактерии Pseudomonas indigofera [123], грибов [83], высших растений [131; 204], нематод [124; 141], клещей [129], насекомых и крыс [10]. Так, из нематоды Caenorhabtilis elegans была очищена ИЦЛ по следующей схеме: высаливание (NTLj^SCXt [33-55%], хроматография на Сефарозе 6В и ДЭАЭ-целлюлозе [140]. Был получен гомогенный фермент с выходом 4% и удельной активностью 2 Е/мг белка. Очистка ИЦЛ, как правило, включала фракционирование сульфатом аммония, ионнообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе и и гель-фильтрацию на различных сефадексах. В некоторых случаях было успешно проведено фракционирование протаминсульфатом, и спиртом с последующей ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе ИЦЛ из эндосперма клещевины. Также описана очистка ИЦЛ из развивающихся эмбрионов клещей Hyalomma аотеаагіі [і29].
До гомогенного состояния ИЦД была очищена из реактивированных куколок бабочки и печени крыс [10]. Очистку проводили по разработанной схеме с некоторыми модификациями к определенному объекту исследованию. Были получены ИЦЛ из куколок бабочек Papilio machaon L. с удельной активностью 5.5 ед. на 1 мг белка, что соответствует очистке в