Изучение механизмов действия белка Rpf - фактора реактивации покоящихся форм актинобактерий

• Автор: Никитушкин, Вадим Дмитриевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 155 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

Глава I. Обзор литературы

1. Пути развития туберкулезной инфекции. Латентное течение заболевания

1.1. Микобактерии и латентность туберкулёзной инфекции

2. Реактивация покоящихся форм микобактерий

3. Особенности строения клеточной стенки покоящихся форм бактерий

3.1 Строение клеточной стенки микобактерий

4. Роль бактериальных гидролаз в регуляции клеточного цикла микобактерий

4.1. Ферменты гидролиза клеточной стенки

4.2. Белки семейства Rpf- пептидогликангидролазы

4.3. Белок Rip - эндопептидаза
5. Молекулярные факторы реактивации покоящихся форм микобактерий. Роль муропептидов в процессе реактивации покоящихся форм бактерий
5.1.Роль бактериальных серин/треонин протеинкиназ в процессе реактивации из покоящегося состояния
6. Современные подходы поиска лекарственных препаратов, направленных против реактивации латентных форм туберкулёза
Глава II. Материалы и методы
Глава III. Результаты и обсуждение
1. Объект исследования - Resuscitation promoting factor
1.2. Изучение структуры белка Rpf методом кругового дихроизма
2. Поиск веществ - ингибиторов ферментативной активности Rpf.
Нитрофенилтиоцианаты
2.1. Влияние структуры НФТ на их ингибирующию способность
2.2. Кинетика ингибирования Rpf нитрофенилтиоцианатами
2.3. Изучение взаимодействия нитрофенилтиоцианатов с Rpf методом тушения собственной флуоресценции белка
2.3.1. Определение поверхностной доступности триптофановых остатков
2.4. Специфичность действия НФТ
2.5. Способность НФТ ингибировать процесс реактивации покоящихся форм микобактерий

3. Изучение механизмов действия белка Rpf в процессе реактивации покоящихся форм микобактерий
3.1. Гипотеза 1. Роль Rpf в разрушении клеточных агрегатов покоящихся форм актинобактерий
3.2. Гипотеза 2. Роль продуктов гидролиза пептидогликана под действием Rpf в процессе реактивации покоящихся форм микобактерий
3.2.1. Действие Rpf на клеточную стенку микобактерий
3.2.2. Роль фрагментов пептидогликана (ФПГ) в процессе реактивации покоящихся форм микобактерий
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА

ВВЕДЕНИЕ
Способность бактерий переживать неблагоприятные условия среды является важным фактором в организации их устойчивости и патогенности. При этом существуют различные пути устойчивости, например, некоторые бактерии образуют споры [Piggot et al. 2004], в то время как другие переходят в состояние низкой метаболической активности - в состояние жизнеспособности, но «некультивируемости» (“Viable but Non-Cuiturable state”) [Oliver JD, 2005].
Бактерии, находящиеся в состоянии покоя (англ. dormancy) характеризуются морфологическими изменениями формы, утолщением клеточной стенки, а также отсутствием роста на типичных питательных средах и способности формировать колонии, поскольку клетки в данном состоянии проявляют низкую метаболическую активность. В частности, клетки, находящиеся в данном состоянии, способны восстанавливать красители, что указывает на проявление их метаболической активности. В некоторых случаях такие бактерии могут быть культивированы в специальных условиях, т.е. может быть проведена процедура реактивации (resuscitation process). Реактивация - это процесс перехода «некультивируемых» клеток в состояние высокой метаболической-активности. Хотя известно, что в природе при наступлении благоприятных условий, процесс перехода в метаболически активное состояние может происходить спонтанно.
Способность микроорганизмов длительное время находиться в метаболически неактивном сосотоянии свойственна более чем шестидесяти* видам бактерий, включая многие патогены человека, такие как Campylobacter sp. - бактерии, которые провоцируют развитие инфекционного заболевания, поражающего желудочно-кишечный тракт; Helicobacter pylori - микроорганизмы, инфецирующие различные отделы желудка; Legionella pneumophila — возбудитель, вызывающий легионеллез, заболевание, поражающее органы дыхания, ЦНС; Salmonella typhimurium - бактерии, которые вызывают сальмонеллез и др.
Mycobacterium tuberculosis, в частности, способен находиться в состоянии покоя десятилетиями. По данным ВОЗ, одна треть населения планеты заражена латентным туберкулезом. Латентная форма туберкулёза может сохраняться на протяжении всей жизни инфицированного индивида, но при ослаблении иммунитета или под действием ряда других, в том числе и неизученных факторов, может переходить в активное состояние, вызывая развитие заболевания.

представляет 6 карманов (А, В, С, Б, Е, Е), причем в А, С и Е может связыватся только 14-ацетилглюкозамин, а в В, Б и Е - как Ы-ацетилглюкозамин, так и Ы-ацетилмурамовая кислота. Происходит разрушение связи между Ы-ацетилмурамовой кислотой в Б сайте и 1Ч-ацетштпокозамином, связанным с Е-сайтом. Молекула субстрата в активном центре принимает конформацию, близкую к конформации переходного состояния. В соответствии с механизмом Филлипса, лизоцим связывается с гексасахаридом, затем переводит 4-й остаток в цепи в конформацию твист-кресла. В этом напряженном состоянии гликозидная связь между центрами Б и Е легко разрушается. Ингибитором лизоцима служит, в частности, трисахарид И-ацетилглюкозамина, связывающийся с каталитически неактивными центрами А, В и С и препятствующий связыванию субстрата.

Лизоцим (РОВ - 1 LZE)