Роль агрегации и образования дисульфидных связей в формировании амилоидных структур естественно развернутыми белками: прионом и казеином

• Автор: Стройлова (Щуцкая), Юлия Юрьевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 211 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Механизм агрегации белков
Естественно развернутые белки
Агрегация, как причина прионных заболеваний
Структура и свойства казеинов
а81-казеин
а82-казеин
р-Казеин
к-Казеин
Образование мицелл
Гомоцистеинилирование как физиологическая посттрансляционная
модификация белков
Гомоцистеин, его свойства и метаболические превращения в клетке
Гипергомоцистеинемия и ее роль в патологических процессах
Пути гомоцистеинилирования белков
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы
Получение разных форм приона
Экспрессия
Очистка
Экстракция
Аффинная хроматография
Хранение

Термоагрегация приона
Агрегация приона при взаимодействии с фосфатидилинозитолом
Гомоцистеинилирование приона
Получение разных форм казенное
Разделение нативных а81, р, к-казеинов молока с помощью анионобменной хроматографии
Получение разных форм рекомбинантного Р-казеина
Экспрессия рекомбинантного Р-казеина
Очистка
Экстракция белков
Хроматографическая очистка
1) Обратнофазовая хроматография
2) Анионобменная хроматография
3) Повторная обратнофазовая хроматография
Димеризация мутантных форм рекомбинантного р-казеина
Протеолиз пепсином и трипсином
Гомоцистеинилирование нативных казеинов
Методы исследования структуры белков и их агрегатов
ДСН-электрофорез в полиакриламидном геле
Г ель-фильтрация
Метод динамического лазерного светорассеяния (ДЛС)
Круговой дихроизм
Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (ИК-
спектроскопия)

Флуоресцентная спектроскопия
Абсорбционная спектроскопия с Конго красным для выявления амилоидов
Количественный анализ включения гомоцистеина с помощью метода определения ЭН-групп по Эллману
Масс-спектрометрия методом ионизации в элсктроспрее
Масс-спектрометрия МАЫ71 ТОБ
Электронная микроскопия
Атомно-силовая микроскопия
Флуоресцентная микроскопия
Расщепление протеиназой К
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Изучение агрегации казеинов
Получение препаратов:
а) разделение казеинов молока
б) получение и очистка цистеинилированных мутантов
Масс-спектрометрия
Исследование свойств мутантов
Димеризация К- и С-концевых мутантов казеина
Мультимеризация двойного мутанта С
Изучение влияния димеризации на процесс образования мицелл методом ДЛС
Изучение влияния димеризации и мицеллизации на вторичную структуру казеина методом кругового дихроизма (КД)

полиморфизмы проявляются в транслируемом белке в трёх позициях: 136, 154 и 171 (Рис.4.). В позиции 136 может стоять Ala или Val (A136V), в позиции 154 Arg или His (R154H), а в позиции 171 Gin, Arg или His (Q171R/H). В основном они встречаются в следующих комбинациях в виде 5-ти аллелей (из возможных 12-ти) именуемых соответственно ARQ, ARR, AHQ, ARH и VRQ. Особи, гомозиготные по аллелю ARR, практически полностью устойчивы к заражению скрейпи, в то время, как гомозиготы по аллелю VRQ, напротив, в значительной степени восприимчивы к заражению.
Рис. 4. Пространственная структура С-концевого домена РгР овец. Изображена скрейпи-подверженная изоформа УВС). Синим отмечены три фенотипически значимых полиморфизма.