Получение и изучение рекомбинантных Fab'-фрагментов антител к афлатоксинам

• Автор: Калиниченко, Артем Андреевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 95 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

I. ВВЕДЕНИЕ

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

И. 1 Общие сведения об афлатоксинах

II. 1.1 Открытие афлатоксинов

II. 1.2 Химические и физические свойства афлатоксинов, их источники... 8 II. 1.3 Воздействие афлатоксинов на организм человека и животных

11.2 Способы детоксикации афлатоксинов в пищевых продуктах и кормах

11.3 Способы детекции афлатоксинов в пищевых продуктах и кормах

11.3.1 Аналитические методы

11.3.2 Скрининговые методы

11.4 Антитела против афлатоксинов: получение и использование
11.5 Системы эксперессии антител
11.5.1 Экспрессия в клетках E.coli
11.5.1 Эксперессия в клетках дрожжей
11.5.1 Эксперессия в культурах клеток животных
И.5.1 Эксперессия в растениях
III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Реактивы
Клетки гибридом и MA
Буферные растворы
Микробиологические среды
Олигонуклеотиды, использованные для ПНР
Использованные методы:
Прямой, непрямой и конкурентный иммуноферментный анализ
Электрофорез белков в ПААТ
Дот-блот анализ
Получение функционально активных Fab'-фрагментов из MA
Выделение мРНК, обратная траскрипция и амплификация вариабельных и
константных доменов MA
Получение генноинженерых конструкций
Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей
Сборка вектора для экспрессии рекомбинантных антител в виде Fab'-
фрагментов
Экспрессия и очистка рекомбинантных Fab'-фрагментов к AflaT
Масс-спектрометрический анализ MA
и рекомбинантных Fab1- фрагментов
Расчет констант диссоциации антител к АфлаТ
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ моноклональных антител против афлатоксинов Вь В2, G2
Определение подтипов легких и тяжелых цепей антител
Амплификация кДНК вариабельных и константных доменов моноклональных антител
Получение плазмидных конструкций для экспрессии рекомбинантных антител
Биосинтез и выделение рекомбинантных Fabфрагментов МА
Определение аффинности и кросс-реактивности Fab-фрагментов
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
АфлаТ - афлатоксины
МА - моноклональные антитела
рАТ - рекомбинантные антитела
БСА - бычий сывороточный альбумин
Fab'-фрагмент - антигеи связывающий фрагмент антитела
scFv - одноцепочечные антитела
ИФА - иммуноферментный анализ
ПЦР - полимеразная цепная реакция
SOE-PCR - ПЦР с перекрывающимися областями
ФНО — фактор некроза опухолей
ПААГ - полиакриламидный гель
ОА - овальбумин
ЛД50 - доза токсина, приводящая к гибели половины испытуемых животных
И50 - концентрация антигена при 50% ингибировании в конкурентном ИФА
ИПТГ - изопропил-1-THO-P-D-галактозид НТО - нетранслируемая область мРНК - матричная РНК кДНК - комплементарная ДНК пДНК - плазмидная ДНК
SRP - signal recognition particle, белковый комплекс распознающий лидерный пептид синтезиремого рибосомой белка
PMSF (phenylmethylsulphonyl fluoride) - фенилметилсульфонил флуорид,
ингибитор сериновых протеаз
ЖЭ - жидкостная экстракция
ТФЭ — твердофазная экстракция
ИАК - иммуноаффинные колонки
ТФЭД - двердофазная экстракция из дисперсии

МА к АфлаТ стали неотъемлемым инструменом для их определения в самых разных источниках. Они обладают рядом важных приемуществ. Нет необходимости в долгой обработке и специальном оборудовании для экстракции АфлаТ из исследуемого субстрата, что значительно сокращает время и стоимость анализа.
Однако, гибридомная технология получения МА дорога. Небольшой молекулярный вес и незначительные структурные отличия молекул АфлаТ не позволяют получать МА высокоспецифичные к определенному типу токсина. В этом отношении представляет интерес получение рекомбинантных антител к АфлаТ с целью изменения их специфичности методами белковой инженерии. Возможно несколько вариантов получения рАТ - в виде полноразмерных молекул, Fab'- фрагментов, мини антител одноцепочечных Fv-фрагментов и др. (рис. 4)
Моноклональные антитела грызунов
Рис. 4. Различные варианты рекомбинантных антител.
Есть ряд работ посвященных получению рАТ к АфлаТ. Так, к АфлаТ В* Мо§]зас1с1ат с соавторами получили бсРу обладающее достаточно высокой аффинностью (Кд = 6 х 10'9)[137]. В работе Раши с соавт. также описано получение одноцепочечных антител к АфлаТ методом скрининга фаговым дисплеем библиотек генов человека[138]. При этом авторам удалось отобрать 3 клона бсРу связывающихся с коньюгатом АфлаТ-БСА, один из которых способен взаимодействовать со свободным АфлаТ В|.