Ферментные системы катаболизма органофосфонатов у почвенных бактерий Achromobacter sp. и Ochrobactrum anthropi GPK 3

• Автор: Свиридов, Алексей Владимирович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 152 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ЕЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1Л. Фосфонаты — соединения с прямой связью углерод-фосфор

1Л Л. Биогенные фосфонаты

1Л.2. Синтетические фосфонаты, их свойства и применение

1.2. Глифосат

1.2.1. Опасность глифосата для окружающей среды и здоровья человека

1.2.2. Воздействие глифосата на бактериальную микрофлору

1.2.3. Экологические последствия широкого применения глифосата

1.2.4. Культурные растения, устойчивые к действию глифосата
1.2.5. Разработка технологий биодеструкции глифосата
1.3. Бактерии-деструкторы фосфонатов и их физиология
1.4. Ферментные системы метаболизма фосфонатов и их регуляция
1.4.1. Фосфонопируватгидролаза и фосфоенолпируватфосфомутаза
1.4.2. Фосфонатаза
1.4.3. Фосфоноацетатгидролаза
1.4.4. С-P лиаза
1.4.5. Утилизация ГФ по С-P лиазному пути
1.4.6. Ранние попытки выделения активной С-P лиазы in vitro
1.4.7. Гены С-P лиазного оперона
1.4.8. Роль фосфита в С-P лиазной реакции
1.4.9. Исследования отдельных компонентов С—Р лиазы
1.4.10. Разнообразие ферментных систем, кодируемых генами оперонаphn
1.4.11. Регуляция экспрессии генов phn
1.5. Глифосат-оксидоредуктаза
1.6. Прочие пути деструкции глифосата
1.7. Методы идентификации фосфонатов и продуктов их метаболизма
ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Использованные реактивы
2.2. Микроорганизмы и их культивирование
2.2.1. Объекты исследования
2.2.2. Условия культивирования
2.3. Получение бесклеточных экстрактов
2.3.1. Фракционирование биомассы О. аШгИорі ЄРК
2.4. Аналитические методы
2.4.1. Спектрофотометрический анализ убыли фосфонатов в среде
культивирования
2.4.2. ВЭЖХ-анализ ГФ и продуктов его деструкции
2.4.3. ТСХ-анализ ГФ и его метаболитов
2.5. Методы определения активности ферментов
2.5.1. Определение активности С-Р лиазы
2.5.2. Определение активности С-Р лиазы II
2.5.3. Определение активности щелочной фосфатазы и ее способности
отщеплять ортофосфат от ГФ и МФК
2.5.4. Определение активности глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы
2.5.5. Определение активности глифосат-оксидоредуктазы
2.5.6. Обнаружение метаболизма АМФК ферментами О. апйігорі ОРК
2.5.7. Определение активности фосфонатазы
2.6. Очистка и характеристика глифосат-оксидоредуктазы
2.6.1. Очистка фермента
2.6.2. Электрофорез в полиакриламидном геле
2.6.3. Определение молекулярной массы нативного препарата ГФ-оксидо-
редуктазы
2.6.4. Изоэлектрофокусировка
2.6.5. Определение оптимума pH и стабильности фермента

2.6.6. Идентификация ФАД как кофактора ГФ-оксидоредуктазы и спектральные исследования
2.6.7. Определение стехиометрии потребления кислорода при расщеплении ГФ
2.6.8. Определение кинетических свойств ГФ-оксидоредуктазы
2.6.9. Определение субстратной специфичности
2.6.10. Оценка влияния металлов и ингибиторов на активность ГФ-оксидоредуктазы
2.6.11. Стабилизация ферментного препарата при хранении
2.7. Определение концентрации белка
2.8. Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Разработка новых методов анализа фосфонатов, продуктов их метаболизма и ферментов катаболизма фосфонатов
3.1.1. ВЭЖХ-анализ ГФ и его метаболитов
3.1.2. ТСХ ГФ и продуктов его метаболизма
3.1.3. Спектрофотометрическое измерение активности ГФ-оксидоредуктазы
3.2. Выбор бактериальных штаммов - деструкторов МФК и ГФ
3.2.1. Адаптация штамма АсИготоЬаШг эр. МРЭ 12 к утилизации ГФ
3.3. Идентификация путей катаболизма фосфонатов у изучаемых штаммов
3.3.1. Метаболизм МФК штаммами АскготоЬаМег ер. МР8 12, МРБ 12А и ОсИгоЬасит апіНгорі вРК
3.3.2. Метаболизм ГФ штаммами АсЪготоЬаМег їр. МР8 12, МР.8 12А и О. аиїНгорі ОРК
3.3.3. Активность щелочной фосфатазы у штаммов-деструкторов фосфонатов
3.3.4. Глифосат-оксидоредуктазная активность и метаболизм образующейся АМФК в бесклеточных экстрактах О. апіИгорі ОРК
3.3.5. Активность фосфонатазы в клетках О. апгорі ОРК 3, выращенных на средах с различными источниками фосфора
3.6. Очистка и характеристика ГФ-оксидоредуктазы О. атИгорі ОРК

логеназ 2-галокислот, куда входили также разнообразные фосфатазы и фосфомутазы. Предполагается, что фосфонатаза и указанные ферменты дивергировали от весьма древней бактериальной дегалогеназы, эволюционируя затем в сторону повышения специфичности и эффективности гидролиза С-P, Р-0 и С-Х связей (Morais et al., 2000b). Действительно, сиквенс гена фосфонатазы не выявил существенных гомологий с известными полипептидами, что позволило говорить о древнем происхождении данного фермента и его длительной независимой эволюции (Dumora et al., 1997).
Подвижность доменов фосфонатазы относительно друг друга приводит к эффекту субстратной активации ферментативной активности. Домены лишенной субстрата фосфонатазы отдалены друг от друга; аминокислотные остатки, образующие активный центр, свободно взаимодействуют с водной средой. При связывании лигандов (ионов магния и фосфоноацетальдегида) происходят конформационные изменения, сближающие домены друг с другом с образованием каталитически активной структуры, стабилизируемой наличием субстрата (Zhang et al., 2002).
Рентгеноструктурный анализ форм фосфонатазы, полученных с помощью сайт-специфического мутагенеза, показал участие в катализе кроме остатков аспарагиновой кислоты и лизина также остатков Гис56 и Мет49, замена которых на аланин приводила к многократному снижению эффективности катализа (kcat/Km). Данные аминокислоты облегчали перенос протона с Лиз53 на иминный интермедиат за счет формирования сети водородных связей с участием молекулы воды (рис. 7) (Morais et al., 2004).
1.4.3. Фосфоноацетатгидролаза
В 1992 г. у P. fluorescens 23F была обнаружена третья высокоспецифичная гидролаза фосфонатов, способная расщеплять С-P связь антибиотика фосфоноацетата с образованием эквимолярных количеств ацетата и Р, (рис. 8). Как фосфонатаза и фосфонопируватгид-ролаза, данный фермент сохранял свою активность при дезинтеграции клеток (McMullan and Quinn, 1992).
Аналогично фосфонопируватгидролазе, синтез данного фермента не зависел от содержания в среде Р,. Это позволяло P. fluorescens 23F утилизировать фосфоноацетат как источник углерода, при этом практически весь образующийся Р, обнаруживался затем в культуральной среде (McMullan et al., 1992; McGrath and Quinn, 1995).
Фосфоноацетатгидролаза была способна катализировать гидролиз С-P связи только у фосфоноацетата, присутствие которого в среде служило единственным фактором индукции данного фермента (McMullan and Quinn, 1994).