Использование бета-спирального домена и пептидил-пролил изомеразы для получения фибриллярного адгезина бактериофага Т4

• Автор: Чупров-Неточин, Роман Николаевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 79 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Гетерологическая экспрессия белков в системе е. coli

1.1. Оптимизация экспрессии без изменения последовательности гена

1.2. Оптимизация экспрессии с изменением последовательности гена

1.2.1. Пептидил-пролил-цис/транс-изомераза E.coli (SLyD)

1.2.2. ß-спиральный С-концевой домен белка gp5 фага Т4 (5EIENS)

2. Структурная организация и общий путь сборки бактериофага Т4

2.1. Базальная пластинка бактериофага Т4

2.2. Процесс инфицирования фагом клетки-хозяина
2.3. Характеристика белкового комплекса длинных хвостовых 26 фибрилл
2.3.1. Структурная характеристика белков длинных хвостовых 28 фибрилл
2.3.2. Структурная характеристика gp37
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Бактериальные штаммы
2.2. Среды для выращивания бактерий и бактериофагов
2.3. Векторы для клонирования. Плазмиды
2.3.1. Векторы для клонирования и экспрессии
2.3.2. Плазмиды с фрагментами ДНК, полученные автором в ходе 35 исследований
2.4. Ферменты
2.5. Полимеразная цепная реакция
2.6. Выделение и очистка ДНК
2.6.1. Очистка фрагментов, амплифицированных с помощью ПЦР
2.6.2. Выделение и очистка плазмидной ДНК
2.7. Количественные определения препаратов ДНК
2.8. Секвенирование ДІІК
2.9. Приготовление компетентных клеток

2.10. Трансформация компетентных клеток E. coli плазмидной ДНК
2.11. Селекция клонов, содержащих рекомбинантные плазмиды
2.12. Экспрессия рекомбинантных белков в клетках E. coli BL21(DE3)
2.13. Электрофорез белков в полиакриламидном геле
2.14. В ыделение белков
2.15. Очистка белков
2.15. Спектр кругового дихроизма
2.16. Ультрацентрифугирование
2.17. Подбор условий кристаллизации
2.18. Малоугловое рентгеновское рассеяние
2.19. Эксперименты по определению биологической активности
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Создание генетических конструкций
3.2. Экспрессия генетических конструкций
3.3. Очистка белков
3.4. Исследование физико-химических, структурных и биологических 52 свойств полученных рекомбинантных белков
3.4.1. Круговой дихроизм
3.4.2. Определение олигомерности белков, гель-фильтрация
3.4.3. Структурная характеристика gpSLYD37TGP
3.4.4. Моделирование молекулярной структуры gpSLYD37TGP 58 низкого разрешения по данным малоуглового рассеяния.
3.4.5. Определение биологической активности gpSLYD37TGP
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
а.о. - аминокислотный остаток БСА - раствор бычьего альбумина ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ДХФ - длинная хвостовая фибрилла ИПТГ - изопропил-1-THo-ß-D-галактозид кДа - килодальтон КД - круговой дихроизм КЭМ - криоэлектронная микроскопия МУР - малоугловое рассеяние ПААГ - полиакриламидный гель ПЦР - полимеразная цепная реакция РНК - рибонуклеиновая кислота ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия ЯМР - ядерный магнитный резонанс E.coli - Escherichia coli gp — продукт гена
PDB - Protein Data Bank
STEM - сканирующая электронная трансмиссионная микроскопия SDS - додецилсульфат натрия
ts - чувствительный к температуре (temperature-sensitive)

Для разведения бактериофагов применяли физиологический раствор (140тМ №С1, ЮтМЪО.,).
Для кратковременного храпения бактериальных культур при 4°С использовали чашки Петри с твердыми питательными средами. Для длительного хранения при — 70°С в жидкую среду с бактериальной культурой добавляли глицерина до 15%.
2.3. Векторы для клонирования. Плазмиды
2.3.1. Векторы для клонирования и экспрессии
рЕТ 23а Novagen, США
рЕТ 28а ИоуаЕеп, США
2.3.2. Плазмиды с фрагментами ДНК, полученные автором в ходе исследований
р371ЧТ1Ч - рЕТ 23а со вставкой ВатШ - Л''о/1. содержащей нуклеотиды 2875-3081 гена 37 бактериофага Т4. Вектор использовали для экспрессии делеционного мутанта gp37NTN.
р37КСТ - рЕТ 23а со вставкой ВатШ - Ыой, содержащей нуклеотиды 2719-ЗОВ 1 гена 37 бактериофага Т4. Вектор использовали для экспрессии делеционного мутанта gp37 КОТ.
р37УРА - рЕТ 23а со вставкой ВатШ - А'о/1. содержащей нуклеотиды 2476-ЗОВ 1 гена 37 бактериофага Т4. Вектор использовали для экспрессии делеционного мутанта gp37 УРА.
р37С1ЧЕ - рЕТ 23а со вставкой ВатШ - Ыой, содержащей нуклеотиды 2377-3081 гена 37 бактериофага Т4. Вектор использовали для экспрессии делеционного мутанта gp37 ОИЕ.
р37ТОР - рЕТ 23а со вставкой ВатШ - Ыой, содержащей нуклеотиды 2254-ЗОВ 1 гена 37 бактериофага Т4. Вектор использовали для экспрессии делеционного мутанта gp37 ТОР.
р5НЕ1Ч8 - плазмида рЕТ23а, несущая под контролем промотора Т7 ген, кодирующий полипептид следующего непрерывного строения: бхЕШ-метка, С-концевой домен белка gp5 бакгериофага Т4, полинкер.