Экспрессионная и метаболитная регуляция функционирования аконитатгидратазы в клетках печени крыс в условиях экспериментального диабета

• Автор: Альнассер Амин
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 130 с. : ил.

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ТЕРМИНОВ

АГ аконитатгидратаза

АМФ - аденозинмонофосфат

АТФ - аденозинтрифосфат

ДТТ - 1,4-дитио-01э-трейтол

БЕАЕ - диэтил аминоэтил

Ов-Иа - додецилсульфат натрия

гц глиоксилатный цикл

изсд - инсулинзависимый сахарный диабет

ицл - изоцитратлиаза

мс малатсинтаза
НАД+ - никотинамидадениндинуклеотид (окисленная форма)
НАДН - никогинамидаденинди нуклеотид (восстановленная форма)
ПААТ - полиакриламидный гель
СФ спектрофотометр
ТХУ - трихлоруксусная кислота
ІДТК - цикл трикарбоновых кислот
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
кт константа Михаэлиса
Мг молекулярная масса
Яг электрофоретическая подвижность
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Особенности биохимических нарушений при диабете
1.1.1. Сахарный диабет и метаболизм глюкозы в животной клетке
1.1.2. Понятие об аллоксановом диабете
1.1.3. Молекулярные механизмы адаптации при диабете
1.1.4. Процесс глюконеогенеза в тканях животных
1.1.5. Функционирование глиоксилатного цикла в тканях животных и человека
1.2. Трансформация глюконеогенеза у животных в экстремальных условиях
1.2.1. Биохимические сведения о трансформации жирных кислот
в углеводы
1.2.2. Роль глюконеогенетических ферментов и интермедиатов
в адаптивной реакции при патологическом состоянии
1.3. Особенности функционирования аконитатгидратазы
1.3.1.Физиологическая роль аконитатгидратазы в обеспечении протекания различных физиолого-биохимических процессов
в живых организмах
1.3.2. Внутритканевая локализация и изоферментный состав аконитазы
1.3.3. Очистка аконитатгидратазы
1.3.4. Физико-химические и каталитические свойства
1.3.5 Регуляция и экспрессия аконитазной активности
под влиянием различных факторов
1.3.6. Роль аконитатгидратазы в обмене железа

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Объект и методы исследования
2.1.1. Объект исследования
2.1.2. Методы исследования
2.1.2.1. Контроль за индукцией диабета
2.1.2.2. Получение материала для исследования
2.1.2.3. Определение активности ферментов
2.1.2.4. Методы очистки аконитатгидратазы
2.1.2.5. Электрофоретические исследования
2.1.2.6. Определение молекулярной массы нативного фермента
2.1.2.7. Ингибиторный анализ
2.1.2.8. Исследование кинетических характеристик и регуляции активности фермента
2.1.2.9. Определение количества белка
2.1.2.10. Определение молекулярной массы изоформ аконитатгидратазы
2.1.2.11. Исследование кинетических характеристик фермента
2.1.3. Выделение суммарной клеточной популяции РНК
2.1.3.1. Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот
в геле агарозы
2.1.3.2. Обратная транскрипция
2.1.3.3. Проведение обратнотранскриптазной полимеразной реакции
2.1.3.4. Проведение полимеразной цепной реакции
в реальном времени
2.1.4. Статистическая обработка результатов
2.2. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
2.2.1. Внутритканевое распространение аконитатгидратазы
2.2.2. Субклеточная локализация и изоферментный состав фермента в различных органах крыс

гепатоцитов интенсивно протекает Р-окисление жирных кислот [18]. И в этой связи представляется принципиально важным тот факт, что максимальная индукция малатдегидрогеназной активности была связана с пероксисомальной фракцией. В предыдущих исследованиях нами было показано, что голодание вызывает индукцию ключевых ферментов глиоксилатного цикла малатсинтазы и изоцитратлиазы также в пероксисомах печени крыс [15]. Вопрос о локализации остальных ферментов глиоксилатного цикла (цитратсинтазы, аконитатгидратазы и малатдегидрогеназы) в животных тканях принципиален, так как для нематоды Ascaris suum была показана их исключительно митохондриальная локализация. Невыясненным остается вопрос о возможной индукции пероксисомальных форм цитратсинтазы и аконитатгидратазы, которое могло бы обеспечить нормальное функционирования полного глиоксилатного цикла в пероксисомах. Для аконитазы на сегодняшний день существуют данные о невозможности ее обнаружения в пероксисомах. Кроме того, было показано, что перекись водорода, интенсивно образующаяся в пероксисомах, может ингибировать данный фермент.
Индукция малатдегидрогеназной активности в' печени крыс при пищевой депривации связана с появлением новой изоформы МДГ, которая была выделена ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-Toyopearl [45]. Исследование ее каталитических характеристик показало существенное сходство с цитозольной формой. Отличительной особенностью данной изоформы является ее большее сродство к НАДИ. Важным для регуляции внутриклеточного распределения малата и оксалоацетата представляется более высокая устойчивость пероксисомальной и митохондриальной форм МДГ к ингибирующему действию сукцината, являющегося продуктом глиоксилатного цикла. Можно сделать предположение, что при голодании в условиях активации глиоксилатного цикла и интенсивной продукции сукцината его последующая мобилизация до оксалоацетата связана с функционированием митохондриальной изоформы МДГ, а далее