Пероксидазная ферментная система проростков пшеницы при развитии окислительного стресса в условиях смены светового режима

• Автор: Томилин, Михаил Вадимович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Нижний Новгород
• Количество страниц: 124 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Введение

1. Обзор литературы

1.1. Свет как компонент сигнальной системы растений

1.1.1. Механизм трансляции светового сигнала

1.2. Стресс; устойчивость; адаптация

1.3. Окислительный стресс

1.3.1. Активные формы кислорода, их образование и роль

1.3.2. Антиоксидантная система

1.4. Пероксидазная система растений

1.4.1.Пероксидаза: общее представление о ферменте

1.4.2.Механизмы окислительных реакций с участием пероксидаз растений
2. Материалы и методы
2.1. Объект исследований и постановка опытов
2.2. Экстракция и определение гемсодержащих белков (ГСБ)
2.3. Определение активности супероксиддисмутазы (СОД), каталазы (КАТ); пероксидазы (ПО)
2.4. Электрофоретический анализ изоформ ПО
2.4.1. Нативный электрофорез белка в ПААГ
2.4.2; Выявление пероксидазной активности и экстракция отдельных изоформ ПО из геля после электрофореза
2.5. Количественный анализ моносахаридов изопероксидаз
2.6. Определение содержания гидропероксидных группировок, супероксид-анион-радикала и антиоксидантов
2.7. Экстракция и определение растворимых фенольных соединений
2.8. Статистическая обработка результатов
3. Результаты и их обсуждение
3.1. Пероксидазная ферментная система этиолированных и экспонированных на свету проростков пшеницы

3.1.1.Влияние света на уровень гемсодержащих белков, локализованных
в апопластном, цитозольном компартментах побегов и корней пшеницы
3.1.2. Динамика светозависимых изменений пероксидазной активности
в апопластном и цитоплазматическом компартментах
ЗЛ.З.Анализ изоферментных спектров пероксидаз
3.1.3.1. Идентификация отдельных изоформ в изоферментном
спектре пероксидаз апопластного и цитоплазматического компартментов
3.1.3.2.Пероксидазная и оксидазная активности отдельных изопероксидаз
и их изменения в процессе экспонирования проростков пшеницы на свету
3.1.3.3. Исследование светозависимой модификации уровня гемсодержащих белков отдельных изопероксидаз и их
углеводных компонентов
3.2. Динамика светозависимой модификации активности супероксиддисмутазы, каталазы в апопластном.и цитозольном
* . компартментах побегов и корней проростков пшеницы
3.3. Изменение генерации супероксидного анион-радикала, гидропероксидных группировок вцитоплазматическом и апопластном компартментах проростков пшеницы при смене светового режима
3.4. Сравнительная характеристика уровня антиоксидантов, растворимых
фенольных соединений цитоплазматической фракции и апопласт-омывающего раствора, экстрагированных из этиолированных и

экспонированных на свету проростков пшеницы
3.5. Сопоставление полученных параметров и выявление возможных связей между изменениями в активности исследованных ферментов и
уровне АФК проростков пшеницы при смене светового режима
Заключение
I Выводы

Список использованных источников

Введение
Актуальность проблемы.
Известно, что любой фоторегулируемый процесс включает несколько последовательных стадий: поглощение кванта, света и образование
электронно-возбужденного состояния' фоторецептора; фотофизическую реализацию энергии возбуждения и сенсибилизацию фотохимической реакции; образование промежуточных фотопродуктов и конечное проявление фотобиологического эффекта (Конев, 1979; Полевой, 1989; Рубин, 1999). Примерами, в которых свет выступает в роли сигнала, является экспрессия; ядерных генов стрессовых белков - ЕЫР, СОР, БЕТ,ШБ и. др., продукты которых регулируют морфогенез- растений (Головацкая, 2009; Осипенкова, 2009). В' частности, опосредованно через; сигнальные белки,, фитохромы А и В модифицируют факторы транскрипции, вызывая экспрессию; генов,. кодирующих пероксидазы (Креславский 2010); Пероксидаза (ПО), имея различные функции (оксидазную и пероксидазную), способна катализировать разнообразные реакции, что- позволяет предполагать, в каталитическом действии. ПО участие двух независимых активных центров (Рогожин, 2004; Газарян;, 2006; Граскова; 2008; Максимов и др., 2011). Этот фермент может выступать как фактор; участвующий в элимировании Н2О2; в; других ситуациях (например, при окислении пиридиннуклеотидов, индолов) - как. источник кислородных радикалов (ЕзспЬапо е1 а1., 2002; Минибаева; Гордон, 2003; Ро§апу е! аЬ, 2006; Огазкоуа е! а1., 2008). Таким-образом, ПО, выполняя (двойственную функцию, может быть вовлечена в контроль уровня АФК и, соответственно, выступать в роли регулятора окислительных процессов; В этой;, связи, представляется актуальным исследовать участие пероксидазной ферментной системы в регуляции окислительно-восстановительных реакций в стрессовых ситуациях, при действии изменяющихся факторов окружающей: среды на растения. Отдельной проблемой является механизм преобразования действия внешнего фактора в изменение активности фермента; также остается слабо

Таблица 2:
Субстратная специфичность некоторых растительных пероксидаз (Алпеева,
Сахаров, 2007).
Субстраты 1с,,1,„,х 10" (М-'с1)
Источник нсроксидазы
батат пальма соя хрен табак арахис люцерна
АБТС 3.5 52.0 0.36 4.0 1.1 0
феруловая к-та 27.0 63.0
о-диаинзидин 0.7 1.0 0.39 4.3 2.0 2
о-фен и лендиамин 1.2 2.9 0.04 0.49 0.03 0
гваякол 0.5 1.2 0.64 1.6 0.51 2
пирокатехин 0.1 0.23
Кислые изоферменты картофеля- (р1~3,5 и -3,7), особенно локализованные в клеточной стенке, имеют высокое сродство, в частности к о-фенилендиамину, люминолу, АБТС, о-дианизидину. В отличие от них щелочные (р1~8,9; -9,2 и -9,3) изоферменты, например из листьев и тканей сердцевины табака, характеризуются низкой активностью, и, вероятно, локализуются в, центральной вакуоли (Максимов, Черепанова, 2006). Для этих изоформ- фермента наиболее специфичны реакции с гваяколом, фенолантипирином и пирогаллоном- (Алпеева, Сахаров, 2007). По мнению Y.G. Gazaryan et al (1994), M.J. Van Haandel et al (1999), J.N. Rodrigues-Lopez et al (2000)- в. отсутствие специфических взаимодействий субстратов с активным центром, субстратная специфичность, по-видимому, должна определяться редокс — потенциалами субстрата, окисленных форм фермента и их стабильностью.
В зависимости от степени окисления иона железа существуют пять различных состояний ПО (рис. 5): восстановленное (2+ или просто 2), окисленное - феррисостояние (3+ или 3), Соединение I (5+ или 5), Соединение II (4+ или 4) и Соединение III (состояние 6+ в оксипероксидазе, образующейся при взаимодействии восстановленного фермента с молекулярным кислородом). Окислительная способность возрастает в ряду феррисостояние < Соединение II < Соединение I < Соединение III в полном соответствии с