Система репарации ДНК у бактерии Mycoplasma gallisepticum

• Автор: Горбачев, Алексей Юрьевич
• Шифр специальности: 03.01.04, 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 141 с. : ил.

Оглавление

Список сокращений

Актуальность работы

Цель работы:

Научная новизна и практическая значимость работы

Апробация работы

Публикации по теме работы

1. Введение

1.1. Общая характеристика и классификация Молликут

1.2. Репарация ДНК и поддержание геномной стабильности у бактерий.

1.2.1. Система SOS ответа
1.2.2. Гомологическая рекомбинация
1.2.3. Система эксцизионной репарации нуклеотидов
1.2.4. Система эксцизионной репарации азотистых оснований
1.2.5. Система репарации мисматчей
1.2.6. Устойчивость ДНК к повреждениям и синтез с низкой точностью
1.3. Гистоноподобный белок HU
2. Материалы и методы
2.1. Олигонуклеотиды
2.2. Культивирование Mycoplasma gallisepticum и получение клеточного экстракта
2.3. Метод торможения ДНК в геле
2.4. Идентификация белков, связывающих мисматчи, из клеточного
экстракта М. gallisepticum
2.5. Гидролиз белков в полиакриламидном геле
2.6. Идентификация белков методом МАЛДИ-МС
2.7. Расчет констант диссоциации
2.8. Получение чистого препарата целевого белка Нир_2 из М.
gallisepticum в клетках Е. сой
2.9. Выделение ДНК
2.10. Комплементационный тест генов hup l и hup_2 из М. gallisepticum в Е.сой

2.11. Выделение РНК и синтез кДНК
2.12. Количественная ПЦР в реальном времени
2.13. Капельно-цифровая ПЦР
2.14. Определение числа копий РНК и ДНК
2.15. Определение предельно переносимых воздействий
2.16. Определение кинетики роста культуры ,
2.17. Праймеры и молекулярные зонды для количественной ПЦР
2.18. Получение клеточного экстракта и разделение белков в одномерном
полиакрамидном геле
2.19. Хромато-масс-спекрометрия
2.20. Анализ масс-спектрометрических данных
2.21. Двумерный гель-электрофорез с дифференциальной окраской
цианинами
2.22. Сравнительный анализ и реконструкция системы репарации
2.23. Статистический анализ изменений уровней мРНК
2.24. Кластеризация генов по паттернам изменения экспрессии при
тепловом шоке
2.25. Измерение АТФ
2.26. Флуорометрическое определение скорости образования перекиси
водорода
3. Результаты и обсуждение
3.1. М. gallisepticum обладает белками, способными распознавать ошибочно спаренные основания в ДНК
3.2. Очистка и идентификация мисматч-связывающих белков М. gallisepticum
3.4. Связывание белка mgHU с поврежденной ДНК сильно при физиологическом значении ионной силы
3.5. Связывание различных ДНК-структур, типичных для репарационного пути MMR
3.6. Комплементационный тест
3.8. Реконструкция системы репарации ДНК у М. gallisepticum
3.9. Представленность транскриптов генов систем репарации в клетке

3.10. Представленность участников систем репарации в клетке на белковом уровне
3.12. Протеомное профилирование в условиях теплового шока
3.13. Тепловой стресс «разгоняет» клеточный метаболизм приводя к повышенному уровню внутреклеточной АТФ, окислительному стрессу,
сопровождающемуся повреждениями ДНК
Заключение
Список литературы
Приложение
Приложение
Приложение
Приложение

AGCAAGTACTCAACTGCACTC TAGACT TJCTTGCTACGACGGATCCC TTAGGTCAG
А1 CTGACCTAAGGGATCCGTCGT AGCAA4GGACTCAACTGCACT CTAGACT AGTCTAGAGTGCAGTTGAG TCCTTGCTACGACGGATCCC TTAGGTCAG
С1 CTGACCTAAGGGATCCGTCGT AGCAACGGACTCAACTGCACT CTAGACT AGTCTAGAGTGCAGTTGAG TCCTTGCTACGACGGATCCC TTAGGTCAG
G1 CTGACCTAAGGGATCCGTCGT AGCAAGGGACTCAACTGCACT CTAGACT AGTCTAGAGTGCAGTTGAG TCCTTGCTACGACGGATCCC TTAGGTCAG
Т1 CTGACCTAAGGGATCCGTCGT AGCAAGG7ACTCAACTGCACT CTAGACT AGTCTAGAGTGCAGTTGAG TCCTTGCTACGACGGATCCC TTAGGTCAG
m2 CTGACCTAAGGGATCCGTCGT AGCAA^CACTCAACTGCACTC TAGACT AGTCTAGAGTGCAGTTGAG TCCTTGCTACGACGGATCCC TTAGGTCAG
m3 CTGACCTAAGGGATCCGTCGT AGCAAA CGCTCAACTGCACTC TAGACT AGTCTAGAGTGCAGTTGAG TCCTTGCTACGACGGATCCC TTAGGTCAG
т4 CTGACCTAAGGGATCCGTCGT AGCAA.4 TG7TCAA Cl GCACTCT AGACT AGTCTAGAGTGCAGTTGAG TCCTTGCTACGACGGATCCC TTAGGTCAG
2.2. Культивирование Mycoplasma gallisepticum и получение клеточного экстракта
Культура клеток М. gallisepticum штамм S6 выращивалась в жидкой среде, содержащей (на 1 литр): 20 г триптозы, 5 г NaCl, Зг Трис, 1,3 г КС1, pH
7.4 с добавлением 1% глюкозы, 50 мл жидкого дрожжевого экстракта, 100 мл лошадиной сыворотки (термически инактивированной при 56°С в течение 30 мин), 200 ед/мл пенициллина. Для экстракции белка 400 мл клеточной культуры (клетки были посеяны 1:100, росли в течение 48 часов) центрифугировали при 4°С, при 16000g, в течение 25 минут. Клеточный осадок трижды промывали буфером, содержащим 200 мМ Трис-НС1 pH 8.0, 150мМ NaCl и 5 мкг/мл PMSF (фенилметансульфонилфторид). Затем клеточный осадок ресупендировали в 8 мл буфера, содержащем 20 мМ Трис-НС1 pH 8.0, ОДмМ ЭДТА и 5 мкг/мл PMSF.