Структурно-функциональный анализ каталитического антитела А.17. Каталитический механизм деградации фосфорорганического пестицида параоксон

• Автор: Куркова, Инна Николаевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 152 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ.
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА

1.1. Каталитические антитела как часть иммунной системы
1.2. Каталитические антитела как искусственные ферменты
ПРОБЛЕМА АНТИДОТНОЙ ТЕРАПИИ ОТРАВЛЕНИЙ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИМИ ТОКСИНАМИ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Одноцепочечное антитело А.17 взаимодействует с фосфорорганическим пестицидом параоксон
2. Создание эукариотической системы экспрессии полноразмерного антитела А
3. Сравнение функциональной активности одноцепочечного и
к полноразмерного антитела А
4. Структурный анализ антитела А
5. Сайт-направленный мутагенез антитела А.17.
Функциональный анализ антитела А.17 и его мутантов
6. Взаимодействие антитела А.17 с пестицидом параоксон
7. Детализация механизма катализа абзима А
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
ХИМИЧЕСКИЕ РЕАКТИВЫ И СОПУТСТВУЮЩИЕ МАТЕРИАЛЫ
реактивы и материалы
ферменты

ингибиторы протеаз
маркеры
антитела и конъюгаты
плазмиды
штаммы E
ЭУКАРИОТИЧЕСКИЕ КЛЕТКИ ЛИНИИ
РАСТВОРЫ
БАКТЕРИАЛЬНЫЕ СРЕДЫ
АНТИБИОТИКИ
МЕТОДЫ
1. РАБОТА С НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ
АМПЛИФИКАЦИЯ ФРАГМЕНТОВ ДНК МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
РЕСТРИКЦИЯ
ЛИГИРОВАНИЕ
ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК
ВЫДЕЛЕНИЕ ГЕНОМНОЙ ДНК
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНК В АГАРОЗНОМ ГЕЛЕ
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНК В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ
ЭЛЕКТРОЭЛЮЦИЯ
СЕКВЕНИРОВАНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК
САЙТ-НАПРАВЛЕННЫЙ МУТАГЕНЕЗ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОГО АНТИТЕЛА А
2. МЕТОДЫ РАБОТЫ С БАКТЕРИЯМИ ESCHERICHIA COLI
ПОЛУЧЕНИЕ ЭЛЕКТРОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК
ТРАНСФОРМАЦИЯ КЛЕТОК ЕCOLT МЕТОДОМ ЭЛЕКТРОПОРАЦИИ

аминокислотной последовательности на поверхности фаговой частицы для связывания с антителом [90]. В основе метода лежит внедрение нуклеотидной последовательности, кодирующей целевой пептид или белок, в область генома фага, ответственную за синтез белков оболочки фаговой частицы. Интегрированные таким образом пептиды/белки экспрессируются (или «представляются») на поверхности фага в виде слитного (фьюжн) продукта с одним из белков оболочки фаговой частицы. Чаще всего в методе фагового дисплея используют вектора на основе геномов нитевидных фагов (fd или- М13) или соответствующие фагемиды. Нитевидные фаги состоят из длинного' цилиндрического белкового капсида (930x6.5 нм), покрывающего одноцепочечную ДНК, длиной порядка 6400-п.о. Белковый капсид в свою очередь состоит из 2700 копий небольшого белка pVIII - продукта гена VIII, размером 5,2 кДа. На одном конце частицы, представлены 3-5 копий белков рУІГи р1Х (гены VII и IX соответственно), а на другом 3-5 копий.белков рИГ и pVI. Фаговые частицы способны инфицировать некоторые грамотрицательные бактерии, включая E. coli, используя в качестве рецепторов половые ворсинки (F-пили). Инфекция нитевидными фагами не вызывает лизиса клеток E. coli, а приводит к тому, что инфицированная клетка продуцирует и секрегирует фаговые частицы в культуральную среду.
“Объемные” ферменты не могут быть клонированы в фаговый геном по гену VIII по стеричсским причинам. Основная часть искусственных ферментов, описанных на сегодняшний день, была создана- с использованием для клонирования области гена III [91]. В результате,, фермент и белок рІП оказываются объединены в один полипептид посредством линкерного пептида. В таких конструкциях все копии (3-5) должны нести клонированный фермент. Однако, на практике, вследствие протеолитической деградации самого фермента или линкера, количество копий сокращается.
Для клонирования ферментов по гену III или VTII могут также быть