Механизмы формирования белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов

• Автор: Абаева, Анастасия Александровна
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 88 с. : ил.

Оглавление
Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Гемостаз

1.2 Тромбоциты

1.3 Субпопуляции активированных тромбоцитов

1.4 Мембранные реакции

1.5 Влияние температуры на свертывание крови

1.6 Трансглутаминазы

1.6.1 Общие сведения о трансглутаминазах

1.6.2 Фактор XIII

1.6.3 Тканевая трансглутаминаза
Постановка задачи
Г лава 2. Материалы и методы
2.1 Материалы
2.1.1 Реагенты
2.2 Методы
2.2.1 Выделение отмытых тромбоцитов
2.2.2 Получение свободной от тромбоцитов плазмы
2.2.3 Титрование активных сайтов тромбина
2.2.4 Проточная цитометрия
2.2.5 Микроскопия
2.2.6 Планшетный спектрофотометр
2.3 Статистическая обработка данных
Глава 3. Результаты
3.1 Роль трансглутаминаз и полимеризации фибрина в формировании покрытия из фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов
3.1.1 Изучение кинетики формирования двух субпопуляций тромбоцитов и распределения покрытия из фибриногена на их поверхности
3.1.1 Выявление механизмов формирования проагрегаторной активности прокоагулянтных тромбоцитов
3.2 Роль полимеризации фибрина в формировании покрытия из тромбоспондина на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов
3.3 Роль трансглутаминаз в формировании прокоагулянтной активности активированных тромбоцитов
3.3.1 Разработка методов количественного измерения прокоагулянтной активности тромбоцитов
3.3.2 Зависимость прокоагулянтной активности тромбоцитов от степени активации.

3.3.3 Влияние тканевой трансглутаминазы на регуляцию прокоагулянтной активности
тромбоцитов
Глава 4. Обсуждение
Выводы
Благодарности
Список литературы
Список сокращений и обозначений

Введение
Свертывание крови представляет собой сложную сеть биохимических реакций, активирующихся при нарушении целостности сосудистой системы. Целью работы системы свертывания является управляемый локальный переход плазмы из жидкого состояния в желеобразное и, как результат, остановка кровотечения. Любые нарушения в тонком балансе этой системы ведут к тяжелым последствиям, связанных с тромбозами или с кровоточивостью.
Неотъемлемыми участниками свертывания крови являются тромбоциты.
Тромбоциты - специализированные клетки, способные к активации. Будучи
активированными, они принимают участие в процессе свёртывания посредством
формирования тромбоцитарного агрегата в месте повреждения кровеносного сосуда, а
также в ускорении плазменного свертывания, путем предоставления своей отрицательно
заряженной фосфолипидной поверхности для сборки ферментативных комплексов.
Поэтому очень важно понимать механизмы регуляции прокоагулянтной и агрегаторной
активности тромбоцитов. Не так давно было обнаружено, что при активации тромбоцитов
двумя физиологическими агонистами (тромбином и коллагеном), образуются две
отличные группы тромбоцитов, одна из которых характеризуется появлением на внешней
мембране фосфатидилсерина и плотного слоя из а-гранулярных белков [Dale G.L. et al.
2002; Dale G.L. 2005]. Рядом ученых было показано, что основные реакции свертывания
крови, такие как сборка комплекса протромбиназы и внутренней теназы, происходят на
поверхности именно этой субпопуляции тромбоцитов, то есть они более прокоагулянтны.
Эти тромбоциты получили название - прокоагулянтные тромбоциты, хотя в литературе
можно встретить и другие названия. Дальнейшие исследования прокоагулянтных
тромбоцитов показали, что, помимо белков а-гранул, они удерживают на своей
поверхности белки свертывания крови: факторы VIII, Villa (здесь и далее буква “а” после
номера фактора означает его активную форму), IX, IXa [Kempton C.L., Hoffman М. et al.
2005; Panteleev M.A. et al. 2005; London F.S., Marcinkiewicz M et al. 2004]. Этот факт также
свидетельствует в пользу того, что основные реакции свертывания крови происходят на
поверхности этой субпопуляции тромбоцитов. Кроме того, еще одной важной функцией
тромбоцитов, как говорилось выше, является формирование тромбоцитарной пробки.
Традиционно считалось, что прокоагулянтные тромбоциты не способны агрегировать из-
за отсутствия у них активированного GPIIbllla [Dale G.L. et al. 2002; Kulkami S., Jackson
S.P. 2004; Bachelot-Loza C. et al. 2006; Cosemans J.M. et al. 2008; Heemskerk J.W. et al.
2012]. Однако в недавней работе Якименко А. О. и коллеги показали, что
прокоагулянтные тромбоциты вовлекаются в агрегаты за счет связывания

соответствует одной клетке. На рис. 12 А представлено распеделение клеток по ББС (боковомуянию) и флуоресценции антител к С061 (антитело к СРШа), которое мы использовали как маркер тромбоцитарный маркер. После чего выделялся регион тромбоцитарных событий - Ш. Дальше производился анализ только тех событий которые попали в этот регион. На контурной диаграмме плотности распределения активированных тромбоцитов по боковому (ББС) и малоугловому (ГЭС) рассеянию выделяли регион одиночных тромбоцитов 112 (рис. 12 Б, по внешней линии) и не пересекающийся с ним регион агрегатов ДЗ (рис. 12 Б, зеленым). Затем все события, попавшие одновременно в регионы Д1 и Д2, изображались на точечной диаграмме распределения по боковому рассеянию (ББС) и флуоресценции меченного флуоресцеинизотиоцианатом (ПТС) аннексина V, связывающегося с фосфатидилсерином на поверхности активированных тромбоцитов (рис.12 В). В программе подсчитывали количество тромбоцитов для разных субпопуляци при разных условиях активации, например для проб с перемешиванием (рис. 12 В,а) и для проб, в которых тромбоциты не подвергались перемешиванию (рис. 12 В,б) (для контроля количества событий использовались калибровочные шарики) (данные предоставлены сотрудником ФНКЦ ДГОИ им. Д. Рогачева Якименко А.О)