Исследование тетраарилтетрацианопорфиразинов в качестве потенциальных фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии и флуоресцентной диагностики

• Автор: Шилягина, Наталья Юрьевна
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 135 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. Обзор литературы

1Л. История развития и принцип метода фото динамической терапии

1.2. Фотосенсибилизаторы для флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии

1.3. Механизмы внутриклеточного и внутритканевого распределения фотосенсибилизаторов
1.4. Флуоресцентные молекулярные роторы в оценке ответа клеток на фотодинамическое воздействие

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Флуорофоры

2.2. Культуры эукариотических клеток

2.3. Животные и опухолевая модель
2.4. Оценка гидрофобности тетраарилтетрацианопорфиразинов
2.5. Анализ спектров поглощения и флуоресценции
2.6. Определение времени жизни возбужденного состояния
2.7. Определение квантового выхода генерации синглетного кислорода
2.8. Исследование динамики накопления
тетраарилтетрацианопорфиразинов опухолевыми клетками
2.9. Исследование поглощения и внутриклеточной локализации тетраарилтетрацианопорфиразинов
2.10. Время-разрешенная микроскопия
2.11. Анализ фотодинамической активности
тетраарилтетрацианопорфиразинов в отношении опухолевых клеток в культуре
2.12. Светодиодный излучатель для получения равномерного светового потока в стандартных 96-луночных планшетах
2.13. МТТ-тест

2.14. Исследование фармакокинетики и специфичности накопления в опухоли тетраарилтетрацианопорфиразинов в эксперименте in vivo
2.15. Исследование специфичности накопления в опухоли тетраарилтетрацианопорфиразинов в эксперименте ex vivo
2.16. Статистическая обработка результатов
Глава 3. Результаты и их обсуждение
3.1. Фотофизические свойства тетраарилтетрацианопорфиразинов
3.2. Исследование динамики накопления и внутриклеточной локализации тетраарилтетрацианопорфиразинов
3.3. Анализ фото динамической активности
тетраарилтетрацианопорфиразинов в отношении опухолевых клеток в культуре
3.4. Исследование фармакокинетики и специфичности накопления в опухоли тетраарилтетрацианопорфиразинов в экспериментах in vivo..
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
Цитируемая литература

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АФК - активные формы кислорода ДМСО - диметилсульфоксид МЦ - метилцеллюлоза
гад - полиимид-графт-поли-Гбутилметакрилат, или полимерные щетки
ПЭГ - полиэтиленгликоль
ФД - флуоресцентная диагностика
ФДТ - фотодинамическая терапия
ЭПР - эндоплазматический ретикулум
ЯМР - ядерный магнитный резонанс
AlgNa - альгинат натрия
FLIM - fluorescence-lifetime imaging microscopy, время-разрешенная флуоресцентная микроскопия
FRAP - fluorescence recovery after photobleaching, восстановление
флуоресценции после фотообесцвечивания
GFP - green fluorescent protein, зеленый флуоресцентный белок
HpD - производное гематопорфирина
ІСТ-состояние - intramolecular charge-transfer state, комплекс с переносом заряда
PBS - phosphate buffered saline, фосфатно-солевой буфер Pz(I) - тетра-4-фтор-фенилтетрацианопорфиразин Pz(II) - тетрафенилтетрацианопорфиразин
TagGFP2 - мономерная мутантная форма зеленого флуоресцентного белка
ТІСТ-состояние - twisted intramolecular charge-transfer state, комплекс с переносом заряда в «скрученной» конформации
YbPz(I) - тетра-4-фтор-фенилтетрацианопорфиразиновый комплекс иттербия
YbPz(II) - тетрафенилтетрацианопорфиразиновый комплекс иттербия
5-АЛК — 5-аминолевулиновая кислота
Дх - длина волны возбуждения
}Чт - диапазон регистрации флуоресценции
hv - энергия фотона, где h - постоянная Планка, v — оптическая частота

достаточный уровень АТФ. При апототической гибели клеток происходит фрагментация ДНК, конденсация хроматина и образование апоптотических телец [46]. Этот процесс «самоуничтожения» клетки строго контролируется на уровне регуляторных белков и участвующих эффекторных ферментов. Ключевую роль в апоптозе играют протеолитические каспазы. Активация каспаз может инициироваться как снаружи, так и изнутри клетки. В первом случае запуск каспазного каскада начинается с активации одного из расположенных на клеточной мембране рецепторов, воспринимающих внешний сигнал (например, Fas, TNF, DR-4, DR-5). Во втором случае, который является наиболее вероятным при фотодинамическом воздействии, сигналы для запуска апоптоза могут исходить от митохондрий, ЭГТР и лизосом [20, 21, 87]. Некроз является пассивным процессом, не требующим энергии. При некрозе наблюдается нарушение целостности и, соответственно, проницаемости мембраны, денатурация белков, выход клеточного содержимого во внешнюю среду [1]. В случае автофагии в цитоплазме клеток происходит накопление мембранных пузырьков, которые содержат обломки органелл. При слиянии аутофагосом с лизосомами происходит образование аутофаголизосом и переваривание их содержимого [ПО].
Молекулярная природа ФС оказывает существенное влияние на путь клеточной гибели, индуцированной фотодинамическим воздействием. Как правило, ФС, локализующиеся в митохондриях или ЭПР, стимулируют апоптоз, в то время как ФС, расположенные в плазматической мембране или лизосомах, индуцируют некроз [147, 196].
Исследование фотодинамической активности и механизмов клеточной гибели является одним из основных начальных этапов при разработке новых препаратов для ФДТ. Вместе с тем необходимо отметить, что единого подхода для этих исследований до сих пор не разработано. Это обуславливает сложность сравнительного анализа данных различных научных групп. В настоящее время не сформулировано единых требований к