Исследование механических свойств клеток и структуры цитоскелета методами атомно-силовой микроскопии

• Автор: Ефремов, Юрий Михайлович
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 143 с. : ил.

Оглавление

Список используемых сокращений

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1 Роль механических свойств клеток в биологии и медицине

2.2 Структурные компоненты животных клеток, определяющие их механические свойства

2.2.1 Клеточная мембрана

2.2.2 Клеточное ядро

2.2.3 Элементы цитоскелета

2.2.4 Актиновый цитоскелет

2.2.5 Регуляция актинового цитоскелета

2.3 Измерение механических свойств животных клеток
2.3.1 Механические модели для описания клетки
2.3.2 Методы измерения механических свойств клеток
2.4 Атомно-силовая микроскопия животных клеток
2.4.1 Принцип действия АСМ
2.4.2 Визуализация животных клеток с помощью АСМ
2.4.3 Взаимодействие кантилевера с клеткой
2.5 Измерение механических свойств животных клеток с помощью АСМ
2.5.1 Силовая спектроскопия клеток
2.5.2 Измерение вязкоупругих свойств клеток
2.6 Особенности структуры цитоскелета и механических свойств опухолевых клеток
2.7 Перспективы использования АСМ для исследования эмбрионов
3. Материалы и методы
3.1 Исследуемые объекты
3.1.1 Фибробласты мыши

3.1.2 Астроциты и нейроны культуры СМГ
3.1.3 Трансформированные и контрольные клеточные линии
3.1.4 Эмбрионы Хепорт Іаегіл
3.2 Методы
3.2.1 Атомно-силовая микроскопия для визуализации объектов
3.2.2 Силовая спектроскопия
3.2.3 Атомно-силовая микроскопия для измерения вязкоупругих свойств..
3.2.4 Реология модельных объектов (полиакриламидных гелей)
3.2.5 Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия и проточная цитофлуориметрия
3.2.6 Статистическая обработка данных
4. Результаты и их обсуяедение
4.1 Разработка методики обработки данных АСМ для измерения механических свойств образца
4.2 Проверка методики на модельных объектах (полиакриламидных гелях).
4.3 Визуализация клеток с помощью АСМ
4.3.1 Сканирование фиксированных клеток на воздухе
4.3.2 Сканирование фиксированных клеток в жидкости
4.3.3 Сканирование живых клеток в среде культивирования
4.4 Силовая спектроскопия клеток с использованием острых кантилеверов.
4.5 Силовая спектроскопия клеток с использованием модифицированных кантилеверов
4.5.1 Влияние положения ядра на измеряемый модуль Юнга клеток
4.5.2 Влияние степени конфлюентности на модуль Юнга клеток
4.6 Сопоставление механических свойств нормальных и трансформированных клеток
4.7 Изучение влияния биохимических воздействий, приводящих к изменению структуры актинового цитоскелета, на нормальные и опухолевые клетки..
4.8 АСМ эмбрионов Хепорил Іаечіз
4.8.1 Исследование фиксированных эмбрионов Хепорш 1аехгз на разных стадиях эмбриогенеза
4.8.2 Исследование живых эмбрионов Хепорш 1аеу1в
4.9 Силовая спектроскопия живых эмбрионов Хепориэ 1аеу
5. Заключение
Выводы
Благодарности
Приложения
Список литературы

Например, с помощью специальных кантилеверов можно вводить в клетку ДНК [95, 178], мРНК [50], или, наоборот, извлекать мРНК из клетки [249].
Продавливание мембраны кантилевером при сканировании в контактном режиме подтверждается также следующими факторами:
- при увеличении силы воздействия цитоскелет становится более рельефным на топографических изображениях, а измеряемая высота клетки уменьшается [86];
- при сканировании в полуконтактном режиме, когда из-за высокой частоты воздействия проявляются вязкоупругие свойства клеток и растет эффективная жесткость, элементы цитоскелета видимы значительно хуже или вообще отсутствуют на изображениях [170, 218];
- высота фиксированных клеток (например, с помощью формальдегида) значительно больше, так как фиксирование на несколько порядков увеличивает жесткость клетки. Элементы цитоскелета после фиксирования обычно не различимы [30, 272];
- высота клеток, измеренная с помощью метода силового картирования (описан далее) при нулевой силе значительно больше, при увеличении силы становятся видимыми элементы цитоскелета [194,195];
- высота клеток больше при измерении методом сканирующей микроскопии на основе ионной проводимости, когда зонд напрямую не контактирует с клеткой и поэтому не оказывает на неё воздействия [200].
Таким образом, при сканировании в контактном режиме можно наблюдать цитоскелет: мембрана легче проминается между его упругими фибриллами. Можно следить за его перестройками в ходе различных процессов, что является интересной и актуальной задачей. Приближенную к истинной топографию поверхности получают при сканировании с очень низкой силой (=30 пН) или в полуконтактном режиме. При этом элементы цитоскелета не видны, а поверхность мембраны в некоторых случаях можно изучать с разрешением 10-20 нм [87]. В таких экспериментах на поверхности мембраны часто наблюдают мелкие объекты, по-видимому, мембранные белки, но идентифицировать их не представляется возможным, так как АСМ в данном случае дает информацию только о морфологии поверхности. Отметим, что при исследовании живых клеток цитоскелет виден не всегда: его не видно на многих опухолевых, эпителиальных, эндотелиальных клетках. Это, по-видимому, связано с его строением в данных типах клеток: с отсутствием толстых пучков фибрилл и/или их расположением относительно мембраны (например, на большой глубине).
Увеличить разрешение метода АСМ можно с помощью процедуры фиксации клеток. Цель фиксации - быстрая остановка биохимических процессов в образце и изменение его