Исследование специфичности и эффективности противоопухолевых препаратов, доставляемых модульными нанотранспортерами

• Автор: Сластникова, Татьяна Александровна
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 145 с. : ил.

Оглавление
Оглавление
1. Введение

2. Литературный обзор

2.1. Противораковые агенты с малым радиусом действия

2.1.1. ФС и фотодинамическая терапия

2.1.2. Распределение фотосенсибилизаторов в клетке и организме

2.1.3. Эмиттеры электронов Оже

2.1.4. Методы присоединения эмиттеров электронов Оже к макромолекулам

2.2. Подходы к направленной внутриклеточной доставке

2.2.1. Методы специфичной для раковых клеток доставки в ядро

2.3. Модульные конструкции для направленного транспорта терапевтических агентов с малым радиусом физического воздействия
2.4. Модульные конструкции для направленного транспорта ФС и других АМРД
2.4.1. Транспорт ФС
2.4.2. Направленная доставка а-эмиттеров
3. Материалы и методы
3.1. МНТ
3.1.1. Структура и состав МНТ
3.1.2. Экспрессия МНТ в бактериальных клетках
3.1.3. Выделение и очистка МНТ
3.1.4. Рефолдинг лигандного модуля МНТ
3.1.5. Трансформация клеток
3.1.6. Измерение концентрации белка
3.1.7. Электрофорез белков
3.1.8 Определение биологической активности а-меланоцит-стимулирующего гормона и МНТ ДТокс-НМР-
СЯЛ-аМСГ
3.1.9. Лиофилизация МНТ
3.2 Получение радиоактивно меченых препаратов МНТ и ЭФР
3.2.1. Получение препаратов МНТ и ЭФР, меченных 1251 при помощи 1,3,4,6-тетрахлоро-За-6а-дифенилгликоурила
3.2.2. Получение препаратов МНТ и ЭФР, меченных 1251 при помощи N [|251]-СГМИБ
3.2.3. Получение препаратов МНТ и ЭФР, меченных 670а при помощи хелатирующего агента на основе 1,4,7-триазоциклононан-1,4,7-триуксусной кислоты
3.3. Получение препаратов МНТ, конъюгированных с ФС
3.3.1. Получение водного раствора тринатриевой соли хлорина е6
3.3.2. Синтез и очистка конъюгатов МНТ с ФС
3.3.3. Активация карбоксильных групп ФС
3.3.4. Синтез конъюгата МНТ
3.3.5. Очистка конъюгата
3.4. Культуры клеток
3.5. Определение количества рецепторов к ЭФР и МНТ на поверхности клеток и констант сродства радиоактивно меченных ЭФР и МНТ к рецепторам
3.6. Анализ кинетики связывания МНТ с ДНК
3.6.1. Модификация поверхности сенсорных чипов
3.6.2. Получение кинетических кривых взаимодействия МНТ с ДНК
3.6.3. Математическая обработка кинетических кривых
3.7. Исследование кинетических характеристик транспорта [12?1|-СГМИБ-МНТ и [Л7Са]-НОТА-МНТ в различных раковых и нераковых клетках
3.7.1. Исследование кинетики поверхностного связывания, накопления и удержания [1251]-СГМИБ-МНТ и [67Оа]-НОТА-МНТ в различных раковых и нераковых клетках

3.7.2. Исследование кинетики транспорта [|251]-СГМИБ-МНТ и [67Ga]-HOTA-MHT в ядра клеток эпидермоидной карциномы человека А431
3.8. Исследование цитототоксического действия [1251]-СГМИБ-МНТ, [67Ga]-HOTA-MHT и [1251]-СГМИБ-апоМНТ на раковые и нераковые клетки в культуре
3.9. Исследование эффективности фотодинамического действия ФС
3.10. Исследование внутриклеточного распределения нанотранспортера в тканях мыши
3.10.1. Прививка опухоли
3.10.2. Введение нанотранспортера
3.10.3. Изготовление и окрашивание срезов тканей
3.10.4. Получение и обработка изображений
3.11. Исследование распределения радиоактивно меченного нанотранспортера в тканях мыши

3.11.1. Прививка опухоли
3.11.2. Используемые растворы МНТ
3.11.3. Введение радиоактивно меченного МНТ и исследование распределения радиоактивной метки в тканях мышей
3.12. Исследование эффективности ФДТ in vivo
3.12.1. ФДТ меланомы B16-F1 у мышей С57/В1аск
3.12.2. Фотодинамическая терапия меланомы Клаудмана S91 (клон М-3) у мышей DBA/2
3.12.3. Фотодинамическая терапия эпидермоидной карциномы человека А431 у мышей Balb/c ByJlco-nu/nu
3.12.4. Оценка результатов ФДТ
4. Результаты
4.1. Специфичность и эффективность противоопухолевых препаратов, доставляемых МНТ in vivo
4.1.1. Оценка влияния долговременного хранения МНТ в лиофилизованном виде в различных условиях связывания на специфичность его связывания с раковыми клетками
4.1.2. Исследование специфичности накопления радиоактивно меченного МНТ in vivo
4.1.3. Исследование специфичности накопления МНТ in vivo методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии
4.1.4. Исследование эффективности фотодинамического действия ФС, доставляемых МНТ in vivo
4.2. Адресная доставка эмиттеров электронов Оже с помощью модульного нанотранспортера в ядра раковых клеток in vitro
4.2.1. Мечение МНТ
4.2.2. Характеристика используемых клеточных линий
4.2.3. Оценка специфичности связывания с раковыми клетками МНТ, модифицированных эмиттерами электронов Оже
4.2.4. Исследование связывания с клеточной поверхностью и внутриклеточного накопления [Ш1]-СГМИБ-(ДТокс-НМР-СЯЛ-ЭФР) и [6,Оа]-НОТА-(ДТокс-НМР-СЯЛ-ЭФР) в раковых клетках
4.2.5. Исследование кинетики удержания в раковых клетках эмиттеров электронов Оже, доставляемых МНТ ДТокс-НМР-СЯЛ-ЭФР
4.2.6. Исследование кинетики накопления эмиттеров электронов Оже, доставляемых МНТ ДТокс-НМР-СЯЛ-ЭФР, в ядрах раковых клеток
4.2.7. Исследование эффективности цитотоксического действия эмиттеров электронов Оже, доставляемых МНТ ДТокс-НМР-СЯЛ-ЭФР, на раковые клетки в культуре
4.3. МНТ с дополнительным уровнем специфичности
4.3.1. Кинетические характеристики связывания МНТ ДТокс-НМР-апоСЯЛ-ЭФР с ДНК
4.3.2. Характеристика используемой клеточной пары изогенных раковых и нераковых клеточных линий
4.3.3. Исследование эффективности фотодинамического действия ФС, доставляемых МНТ ДТокс-НМР-апоСЯЛ-ЭФР
4.3.4. Исследование кинетики связывания с поверхностью и внутриклеточного накопления эмиттеров электронов Оже, доставляемых МНТ ДТокс-НМР-апоСЯЛ-ЭФР
4.3.5. Исследование эффективности цитотоксического действия эмиттеров электронов Оже, доставляемых МНТ ДТокс-НМР-апоСЯЛ-ЭФР
5. Обсуждение результатов
5.1. Специфичность и эффективность противоопухолевых препаратов, доставляемых МНТ in vivo

5.2. Эффективность цитотоксического действия эмиттеров электронов Оже, доставляемых в
ядра раковых клеток модульным нанотранспортером in vitro
5.3. МНТ с дополнительным уровнем специфичности
6. Заключение
7. Выводы
8. Список сокращений и условных обозначений
9. Список литературы
10. Благодарности

• Для селективной доставки именно в клетки-мишени, транспортер должен содержать лиганд к рецептору, который специфичен для клеток-мишений и сверхэкспрессирован на них.
• Чтобы конструкция эффективно поглощалась клетками необходимо использование лиганда к интернализуемому рецептору.
• В состав транспортера должен входить сигнал внутриклеточной локализации, опосредующий доставку АМРД в те компартменты клетки, где эффективность цитотоксического действия данного вещества максимальна.
• Для выхода из эндосом в гиалоплазму клетки и обеспечения тем самым условий дальнейшего транспорта в намеченные компартменты клеток, а также для предотвращения попадания в лизосомы, в состав транспортера вводится эндосомолитический модуль.
• В состав транспортера должен входить модуль-носитель, который объединяет другие модули воедино.
• Включение каждого из функциональных блоков в состав транспортера не должно существенно изменить те его свойства, которые необходимы для эффективной доставки АМРД (Соболев и др. 2004).
Например, в качестве лиганда, обеспечивающего клеточную специфичность доставки, могут использоваться пептидные гормоны и факторы роста: инсулин (гепатомы, глиомы), инсулиноподобный фактор роста
(нейробластомы и остеосаркомы), фактор роста нервов (нейробластомы и глаукомы), меланоцит-стимулирующий гормон (меланомы), ЭФР (рак молочной железы, легких, шеи; глиобластомы), соматостатин; а также опухолеспецифичные интернализуемые антитела (Соболев и др. 2004). Для направленного транспорта в клеточное ядро применяются сигналы ядерной локализации (СЯЛ), например, модифицированный СЯЛ большого Т-антигена вируса 5К-40; модульные последовательности, например, М9 (из мРНК-связывающего белка кпНЫР А1