Структура, динамика и механизм димеризации трансмембранного домена белка-предшественника бета-амилоида

• Автор: Надеждин, Кирилл Дмитриевич
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 112 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Белок-предшественник бет а-амилоида

111 Пути протеолиза ПБА

112 Структура ПБА

113 Биологическая роль ПБА

1.2. ДИМЕРИЗАЦИЯ ПБА

121 Димеризация полноразмерного ПБА и его внеклеточных доменов

12 2 Димеризация трансмембранного домена ПБА

12 3 Изучение димеризации ПБА флюоресцентными методами
12 4 Изучение димеризации ПБА при помощи мутагенеза
12 5 Изучение димеризации ТМдомена при помощи ТОХ-сиспгем
12 6 Исследование димеризации ПБА методом ЯМР
12 7 Исследования димеризации ТМ домена т sihco
Выводы
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2 11 Штаммы и плазмиды
2 12 Среды для выращивания Е coli
2 13 Ферменты
2 14 Олигонуклеотиды и секвенирование генов
215 Реактивы
2.2. Методы
2 2 1 Сборка жспрессионного вектора pGEMEX-l/(TRX-APPjmtm)
2 2 2 Денатурирующий эчектрофорез белков вДСН-ПААГ
2 2 3 Подбор условий индукции ИПТГ
2 2 4 Культивирование рекомбинантного штамма Е coli
2 2 5 Выделение гибридного белка Trx-APPjmtm из клеточной кучьтуры
2 2 6 Получение трансмембранного пептида
2 2 7 Масс-спектрометрия
2 2 8 Измерение pH образца
2 2 9 Приготовление образцов ЯМР
2 2 10 Спектроскопия ЯМР
2 2 11 Отнесение сигналов
2 2 12 Опредечение значений рК Glu693 и Asp694
2 2 13 Опредечение кинетических параметров перехода мономер-димер вмицеллярном окружении
2 214 Иссчедование ЯМР релаксации
2 2 15 Почучение верхних ограничений на расстояния
2 216 Получение ограничений на двугранные углы ip и у основной цепи
2 2 17 Измерение остаточных дипольных констант
2 2 18 Расчет пространственной структуры
2 2 19 Опредечение положения пептида в мицечле
2 2 20 Взаимодействие APPjmtm с аналогом холестерина
2 2 21 Расчет гидрофобных свойств поверхности пептида и конструирование карты гидрофобности
поверхности ТМ спирачи
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3 1 Получение рекомбинантного трансмембранного домена АРР686-726 (APPjmtm)
3 2 Оптимизация усчовий экспрессии
3 3 Подбор концентрации тромбина
3 4 Очистка APPjmtm
3 5 Проверка идентичности APPjmtm методом иасс-спектроиетрии
3 6 Отнесение сигначов в спектрах ЯМР
3 7 Опредечение значения рК карбоксгсчьных групп боковых цепей Glu693 и A sp694
3 8 Константа димеризации APPjmtm в мицеллах ДФХ
3 9 Элементы вторичной структуры

З 10 Динамические характеристики АРР]тІт
3 11 Опредеіение водородных связей
З 12 Измерение остаточных дипольних констант
З 13 Расчет пространственной структуры пептида
З 14 Межмономерные контакты и расчет структуры димера
3 14 Свойства поверхности димера и интерфейсы димеризации
3 15 Взаимодействие комплекса пептид/мицелла с аналогом холестерина
3 16 Определение положение пептида в мицелле
Выводы
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ
AICD - APP intracellular domain, внутриклеточный домен ПБА
ВАСЕ1 - ß-site APP cleaving enzyme, ß-секретаза
C99/ßCTF - ß-site C-terminal fragment (С-концевой фрагмент ПБА после гидроли-
за ß-секретазой)
E. coli - Escherichia coli
FRET - Förster resonance energy transfer, Фёрстерский резонансный перенос
энергии
IAEDANS - 5-({[(2-iodoacetyl)amino]ethyl}amino)naphthalene-l-sulfonic acid
IANBD - N,N-dimethyl-N-(iodoacetyl)-N-(7-nitrobenz-2-oxa-l,3-diazol-4-
yßethylenediamine;}
GpA - гликофорин А человека
GPCR - G-белок сопряженные рецепторы
MTSL - 2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl methanethiosulfonate
ODjjo - оптическая плотность (на длине волны 550hm)
PDB - Protein Data Bank
P/D или D/P - пептид/детергент или детергент/пептид (молярное соотношение)
Т і - время продольной ЯМР релаксации
'Г2 - время поперечной ЯМР релаксации
ТВ - Terrific Broth
TrxA/Trx - тиоредоксин E
а. о. - аминокислотный остаток
ДСН - додецилсульфат натрия
ДФХ - додецилфосфохолин
ДМФХ - димиристоилфосфатидилхолин
ДГ ФХ - дигексаноилфосфатидилхолин
ЛМФХ - лизомиристоилфосфатидилхолин
ДСС - 2,2-диметил-2-силапентан-5-сульфоната натрия
ИПТГ - H3onpoiiHn-ß-D-THoranaKT03Hfl
кДа - килоДальтон
ККМ - критическая концентрация мицеллообразования
КССВ - константа спин-спинового взаимодействия
МХАХ - металлохелатная аффинная хроматография
об/мин - обороты в минуту

Выводы
Данные разных исследовательских групп с применением различных методик и условий проведения экспериментов приводят порой к противоречивым выводам. Все сходятся на том, что ПБА димеризуется, однако вопрос о смысле димеризации остается открытым. Наиболее полно механизмы ассоциации и влияния на нее каждого остатка полипептидной цепи рассмотрены для ТМ домена белка. Разнообразие полученных результатов и способов димеризации говорит о том, что проблема установления механизмов болезни Альцгеймера на молекулярном уровне многогранна. Для ее решения требуется междисциплинарный подход. Современное развитие физико-химических методов исследования в области биологии и медицины позволяет на новом, более глубоком Уровне установить молекулярные основы патофизиологических процессов, происходящих в организме человека. Для направленного создания новых лекарств, необходимых для адекватной терапии этого нейро-дегенеративного заболевания, нужно знание пространственной структуры и принципов функциональной димеризации ПМ и ТМ участков битопного белка ПБА (в том числе его патогенных мутантных форм).
При структурно-динамических исследованиях необходимо учитывать, что процессинг ПБА инициируется и происходит при различных физиологических условиях (при вариации pH, концентраций ионов металлов и состава мембраны) как во внешней плазматической мембране, так и в эндосомах [33]. Несмотря на определенные успехи в работах с бета-амилоидами [63], на данный момент для полноразмерного ТМ домена ПБА и его димерных форм существуют только грубые модели, основанные на немногочисленных биохимических и структурных данных [28-30,32,33,37]. Влияние патогенных мутаций на олигомерную конформацию ТМ домена ПБА требует прямых экспериментальных доказательств и соответствующих структурнодинамических исследований. Такие исследования возможны при современном уровне развития методов структурной биологии.