Изучение кольцевых и фибриллярных белков, преобразующих энергию деполимеризации микротрубочек в движение

• Автор: Волков, Владимир Алексеевич
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 94 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Возможные механизмы митоза

1.2 МИКРОТРУБОЧКА - ДРЕВНИЙ БИОЛОГИЧЕСКИЙ МОТОР

1.3 Механизм перемещения груза деполимеризующейся микротрубочкой

1.4 Генерация сил выгибающимися протофиламентами

1.5 Сопряжение объектов с разбирающейся микротрубочкой

1.5.1 Кольцевые сопрягаюгцие устройства

1.5.2 Количественный флюоресцентный анализ комплексов Daml

1.5.3 Некольцевые сопрягатели

1.6 Постановка задачи
ГЛАВА 2. МЕТОДЫ
2.1 Бактериальная экспрессия, очистка и мечение комплекса Dam 1
2.2 микроскопические исследования взаимодействия флюоресцентных комплексов DamI с микротрубочками
2.3 Работа с шариками, покрытыми DamI
2.4 Шарики, покрытые компонентами комплекса KMN
2.5 Получение изображений и сбор данных
2.6 Электронная микроскопия
2.7 Анализ данных
2.8 Математический анализ кинетики выцветания точек
2.8.1 Математический анализ кривых выцветания
2.8.2 /1лгорипш аппроксимации Гауссовыми распределениями
2.8.3 Алгоритм PDF
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КОМПЛЕКСОВ DAM1 С МИКРОТРУБОЧКОЙ
3.1 Комплексы DamI, устойчиво двигающиеся с концом разбирающихся микротрубочек, не меняют свой размер
3.2 Следующий за концом микротрубочки комплекс DamI является кольцом, но не большим комплексом
3.3 Двигающийся комплекс DamI теряет субъединицы, когда наталкивается на крупный неподвижный КОМПЛЕКС
ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ШАРИКОВ, ПОКРЫТЫХ DAM1, С МИКРОТРУБОЧКОЙ
4.1 Связанный с концом микротрубочки шарик скользит вдоль ее поверхности в присутствие DamI в растворе
4.2 Покрытые DamI шарики могут следовать за концами микротрубочек
в отсутствие колец
4.3 В отсутствие растворимого DamI шарики, покрытые DamI, катятся, а НЕ СКОЛЬЗЯТ

ГЛАВА 5. РЕЗУЛЬТАТЫ. НЕКОЛЬЦЕВЫЕ И ФИБРИЛЛЯРНЫЕ СОПРЯГАТЕЛИ
5.1 Некольцевые комплексы DamI имеют разный размер и быстро диффундируют
5.2 НЕКОЛЬЦЕВЫЕ КОМПЛЕКСЫ DAMl МОГУТ СЛЕДОВАТЬ ЗА КОНЦОМ РАЗБИРАЮЩЕЙСЯ МИКРОТРУБОЧКИ
5.3 ФИБРИЛЛЯРНЫЕ СОПРЯГАТЕЛИ
ГЛАВА 6. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
6.1 Кинетические и сопрягающие свойства олигомеров DamI in vitro
6.2 По поводу структуры комплексов Dam 1, функционирующих на
КИНЕТОХОРАХ ПОЧКУЮЩИХСЯ ДРОЖЖЕЙ
6.3 Поведение покрытых DamI шариков в отсутствие растворимого DamI: сравнение наших результатов с опубликованными данными
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
М, мМ, мкМ, нМ моль/л, миллимоль/л, микромоль/л, наномоль/л
пН пиконьютон
мкм, нм микрометр, нанометр
мин минута
сек, с секунда
Да, кДа Дальтон, килоДальтон, единица молекулярной массы
у. е. условные единицы
n, N размер выборки
DamI Duol and Mpsl interacting protein - «белок,
взаимодействующий с Duol и Mpsl»; также комплекс
DamI/DASH
KMN Суперкомплекс, состоящий из белка Knll и комплексов
Mis 12 и Ndc
KNL1 Kinetochore-Nul] phenotype - «фенотип с отсутствующим
кинетохором»
Ndc80 Nuclear division cycle - белок, находящийся в ядре клетки и
участвующий в ее делении, массой 80 кДа
АТФ аденозинтрифосфат
ГТФ гуанозинтрифосфат
ЕДФ гуанозиндифосфат
in vitro «в пробирке», эксперимент проводится на смеси
очищенных компонентов
in vivo эксперимент проводится на живом организме или клетке
РНК рибонуклеиновая кислота
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
таксол паклитаксел, бензоат (2а,4а,5|3,7р, 10(3,1 За)-4
бис(ацетилокси)-13- {[(2R;3S)- 3-(бензиламино)
меркаптоэтанол). Приготовление проточных камер и очистка тубулина проводились как описано в работах (Grishchuk et al., 2005; Grishchuk and Ataullakhanov, 2010). В экспериментах, где требовалось геометрически заблокировать образование колец, микротрубочки полимеризовались из смеси немеченного и биотинилированного тубулина в соотношении 2.5:1, стабилизировались добавлением таксола и прикреплялись к покровному стеклу, покрытому стрептавидином (0.5 мг/мл биотинилированного BSA, промывка, затем 0.5 мг/мл стрептавидина). Это позволяло получить микротрубочки, присоединенные к подложке по всей длине, следовательно кольцо не могло обхватить микротрубочку. В остальных экспериментов для нуклеации микротрубочек использовались адсорбированные на покровное стекло очищенные аксонемы, полученные из хламидомонад, или инактивированные клетки Tetrahymena. Рост микротрубочек индуцировался вмыванием в проточную камеру, находящуюся под микроскопом при температуре 32°С, 1-3 мкМ тубулина в 40 мкл буферного раствора, содержащем 1 мМ ГТФ, 80 мМ К-Pipes pH 6.9 (BRB-80), 0.5 мг/мл казеина и 1 мМ DTT. Рост трубочек продолжался в течение 5-10 минут при визуальном контроле с помощью дифференциального интерференционного контраста. Затем для стабилизации плюс-концов микротрубочек раствор менялся на содержащий те же компоненты, но со следующей модификацией: вместо немеченного тубулина добавлялся меченый родамином в концентрации 0.5-1 мкМ, а вместо ГТФ добавлялся его негидролизуемый аналог GMPCPP (гуанозин-5'-[(а,р-метилено]трифосфат) в концентрации 0.5 мМ. После этого инкубация продолжалась еще 5-10 минут. Затем камера промывалась 100 мкл того же раствора без нуклеотидов и тубулина и 20 мкл раствора, в котором в последствии вмывался DamI. Разборка микротрубочек запускалась облучением ртутной лампой НВО100, свет которой был отфильтрован для возбуждения краски Texas Red.