Выявление и характеристика каинатных рецепторов гамкергических нейронов гиппокампа, управляющих синхронной активностью популяции нейронов в культуре

• Автор: Кононов, Алексей Владимирович
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 100 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИИ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1.Каинатные рецепторы
1.1.1. История открытия
1.1.2. Структура и функции
1.1.3. Роль каинатных рецепторов в работе нейронов гиппокампа
1.2.Молекулярные механизмы секреции нейромедиатора
1.2.1. Зависимость скорости выброса нейромедиатора от концентрации кальция
1.2.2. Локальные кальциевые домены
1.2.3. Потенциал-чувствительные кальциевые каналы и их роль в секреции нейромедиаторов
1.2.4. Вклад КуЛ-опосредованного выброса кальция из эндоплазматического ретикулума в секрецию нейромедиаторов
1.2.5. Вклад пресинаптических митохондрий в секрецию нейромедиаторов
1.3.Спонтанные осцилляции нейронов
1.3.1. Влияние потенциал-чувствительных кальциевых каналов на спонтанные осцилляции нейронов
1.3.2. Влияние ионотропных глутаматных рецепторов на спонтанные осцилляции нейронов
1.3.3. Влияние метаботропных глутаматных рецепторов на спонтанные осцилляции нейронов
1.3.4. Влияние ГАМКергических нейронов на спонтанные осцилляции нейронов
1.4.Селективная гибель популяций нейронов при различных патологиях
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1.Получение культуры клеток гиппокампа
2.2.Измерения уровня цитозольного кальция методом флуоресцентной микроскопии
2.3.Система быстрой аппликации веществ
2.4.Иммуноцитохимический метод выявления ГАМКергических нейронов
2.5. Материалы
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1.Анализ активности агонистов каинатных рецепторов
3.2.Распределение амплитуд кальциевых ответов нейронов на агонисты каинатных рецепторов
3.2.1. Увеличение амплитуды кальциевых ответов нейронов с возрастом культуры
3.2.2. Десенситизация каинатных и АМРА-рецепторов
3.3.Характеристика агонистов каинатных рецепторов

3.4.Регистрация активности антагонистов каинатных рецепторов
3.4.1. Определение константы ингибирования каинатных рецепторов конкурентным антагонистом ИВ(2Х
3.4.2. Определение типа ингибирования
3.5.Выявление участия каинатных рецепторов в синхронных спонтанных кальциевых осцилляциях
3.6.Действие агонистов каинатных рецепторов на ССКО
3.7.Действие селективных агонистов каинатных рецепторов на синхронные спонтанные кальциевые осцилляции
3.8.Нейроны с максимальными АКО
3.9.Выявление ГАМКергических нейронов иммуноцитохимическими методами
3.10. Определение пре- или постсинаптической локализации каинатных рецепторов, управляющих синхронной активностью нейрональной сети
ВЫВОДЫ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АКО - амплитуда кальциевого ответа БА - болезнь Альцгеймера
ВПСП - возбуждающие постсинаптические потенциалы ВПСТ - возбуждающие постсинаптические токи ГАМК - гамма-аминомасляная кислота
ЕС50 - концентрация вызывающая полумаксимальный эффект КА - каиновая кислота КА-рецептор - каинатный рецептор
СопА - конканавалин А, блокатор десенситизации каинатных рецепторов
мПСТ — миниатюрные постсинаптические токи
мТПСТ — миниатюрные тормозные постсинаптические токи
С а-А/К - кальций-проводящие АМР А- и КЛ-рецепторы
ССКО - синхронные спонтанные кальциевые осцилляции
ТПСП — тормозные постсинаптические потенциалы
АСЕТ — селективный агонист каинатных рецепторов, содержащих СНиК5-субъсдиницу АМРА — альфа-амипометилизоксазолпроиионовая кислота, агонист АМРА-рецепторов AMPAR - ионотропный рецептор глутамата, селективно связывающий АМРА АР5 — селективный конкурентный антагонист NMDA-рецепторов
АТРА — селективный агонист каинатных рецепторов, содержащих GluR5-субъединицу
СаМКИ - кальмодулин-зависимая протеин киназа II
CNQX - конкурентный антагонист АМРА- и КА-рецепторов
CTZ — циклотиазид, блокатор десенситизации каинатных рецепторов
DA - домоевая кислота
DIV - время культивирования клеток в днях (day in vitro)
DNQX - конкурентный антагонист АМРА- и КА-рецепторов ER - эндоплазматический ретикулум
FW - фторвиллардиин селективный агонист АМРА-рецепторов GAD65/67 - глутаматдекарбоксилаза 65/67
GFP - зеленый флуоресцирующий белок (Green fluorescent protein)
GluR5/6/7, KAI/2 - субъединицы каинатного рецептора GRIK1-5 - гены, кодирующие субъединицы каинатного рецептора GYKI-52466 - селективный неконкуретный антагонист АМРА-рецепторов GYKI-53655 - селективный неконкуретный антагонист АМРА-рецепторов IC50 - концентрация лиганда, вызывающая полумаксимальное подавление IP3 - инозитол-1,4,5-трифосфат
LTP — долговременная потенциация (Long-term potentiation)
МК-801 - неконкурентный антагонист NMDA-рецептора NBQX - конкурентный антагонист АМРА- и КА-рецепторов NMDA-N-метил-О-аспартат
NMDA-рецептор - ионотропный рецептор глутамата, селективно связывающий NMDA
РКА - протеинкиназа А
РКС - протеинкиназа С
RyR - рианодиновый рецептор
SNARE - группа белков, осуществляющих слияние внутриклеточных транспортных везикул с клеточной мембраной (SNAp REceptors)
SNV - селективная чувствительность нейронов к повреждению (Selective Neuronal Vulnerability)

мысль об участии NMDA-рецепторов в их происхождении. NMDA-рецепторы характеризуются наличием магниевого блока, снятие которого происходит либо в безмагниевой среде (нефизиологические условия), либо при деполяризации. И поэтому активация вызванных глутаматом кальциевых осцилляций именно в безмагниевой среде явилась косвенным доказательством участия в них NMDA-рецепторов. Позднее Robinson
Н.Р. с коллегами показали, что основу спонтанной кальциевой активности в среде с низкой концентрацией магния составляют пачки потенциалов действия (Robinson et al., 1993).
Такие спонтанные осцилляции нейронов наблюдаются и в ходе раннего постнатального развития животных in vivo. Так, можно наблюдать синхронные спонтанные колебания активности нейронов поля СА1 гиппокампа с частотой 0,33 и 0,1 Гц во время иммобилизованного состояния у крыс, а также во время их сна и питания. Такие колебания являются результатом синергичного влияния возбуждающего действия ГАМК и глутамата (Leinekugel et al., 2002).
В культуре клеток гиппокампа показаны следующие сменяющие друг друга формы спонтанной активности нейронов:
Синхронные платообразные осцилляции (SPAs). Во время эмбрионального развития синхронная активность отсутствует, но наблюдаются несинхронные, зависящие от L-типа кальциевых каналов, кальциевые спайки. Во время рождения под влиянием материнского гормона окситоцина в гиппокампе индуцируются SPAs, которые наблюдаются в течение нескольких дней. Они представляют собой кальциевые сигналы, сопровождающиеся электрическими разрядами, и наблюдаются в небольших группах нейронов, связанных щелевыми контактами (также называемые электрическими синапсами). После образования синаптических контактов кальциевые сигналы исчезают (Crepel et al., 2007).
Гигантские деполяризационные потенциалы (ГДП). В нейронах поля САЗ in vitro (на срезах) в течение первых восьми дней более чем в 85% нейронов наблюдались спонтанные ГДП с частотой 0,005-0,2 Гц. Частота потенциалов снижалась между 9-м и 12-м днем постнатального развития (48%) и исчезала после 12-го дня. Потенциалы блокировались аппликацией бикукуллина (ЮмкМ) или пикротоксина (100-200мкМ), а их частота уменьшалась при действии антагониста NMDA-рецепторов АР-5 (10-50мкМ). Во время второй недели развития, когда ГДП становились редкими или исчезали, добавление