Влияние минорных модификаций первичной структуры на физико-химические свойства и шапероноподобную активность бета-казеина

• Автор: Коннова, Татьяна Анатольевна
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 158 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Е Казенны - основные белки молока млекопитающих

1Л Л. Общая характеристика основной казеиновой

фракции - бета-казеина

1Л Л Л. Видовое разнообразие бета-казеина

1Л Л .2. Структура бета-казеина

1Л Л .3. Ассоциативные свойства бета-казеина

1.2.Шапероны, механизм шаперонного действия
1.2 Л. Шапероноподобные свойства бета-казеина
1.3.Методы модифицирования структуры белков
1.3.1. Химическое модифицирование
1.3.2. Ферментативное модифицирование
1.3.3. Генетическое модифицирование
1.3.4. Физическое модифицирование
1.3.4.1. Взаимодействие белков с растворителем
1.3.4.2. Влияние короткоцепочечных спиртов на структуру воды и белков
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 .Объекты исследования
2.2.Получение рекомбинантных бета-казеинов
2.2.1. Модифицирование последовательности бета-казеина дикого типа методом сайт-направленного мутагенеза
2.2.2. Трансформация клеток E.coli методом

электропорации
2.2.3. Штаммы для экспрессии рекомбинантных бета-казеинов
2.2.4. Экспрессия белков в клетках Е.соИ
2.2.5. Выделение и очистка рекомбинантных белков
2.2.5.1. Экстракция белков
2.2.5.2. Хроматографическая очистка
2.3.Приготовление образцов
2.4. Исследование физико-химических свойств бета-казеина
2.4.1. Масс-спектрометрия
2.4.2. Жидкостная хроматография высокого давления (ВЭЖХ)
2.4.3. Олигомеризация рекомбинантных бета-казеинов
2.4.4. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле (ПААТ) в денатурирующих условиях
2.4.5. Динамическое лазерное светорассеяние
2.4.6. Флуоресцентная спектроскопия
2.4.7. Спектроскопия кругового дихроизма
2.4.8. Инфракрасная спектроскопия с преобразованием
Фурье (ИК-спектроскопия)
2.5.Исследование шапероноподобных свойств бета-казеина
2.5.1. Тепловая денатурация АДГ и каталазы
2.5.2. Тепловая денатурация моноклональных иммуноглобулинов в (в)
2.5.3. Каталитическая активность АДГ
ГЛАВА 3. СТРУКТУРНЫЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕТА-КАЗЕИНОВ

3.1.Получение препаратов рекомбинантных бета-казеинов
3.1.1. Экспрессия рекомбинантных бета-казеинов в клетках Е.соН
3.1.2. Лизис клеток бактериального продуцента бета-казеина
3.1.3. Хроматографическая очистка рекомбинантного бета-казеина
3.1.4. Молекулярная масса и степень очистки препаратов рекомбинантного белка
3.2. Олигомеризация цистеинсодержащих бета-казеинов
3.3. Влияние внутри- и межмолекулярных дисульфидных связей на процесс самоассоциации бета-казеина
3.4. Вторичная структурная организация цистеин-
содержащих бета-казеинов
ГЛАВА 4. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕТА-КАЗЕИНА В ВОДНО-ЭТАНОЛЬНЫХ РАСТВОРАХ
4.1.Самоассоциация нативного бета-казеина в водно-этанольных смесях
4.2.Самоассоциация рекомбинантного бета-казеина С0-208 в водно-этанольных смесях
4.3.Влияние растворителя на вторичную структуру нативного бета-казеина
4.4.Возможная модель действия этанола на структуру и ассоциативные свойства бета-казеина
ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ ВНЕСЕННЫХ МОДИФИКАЦИЙ СТРУКТУРЫ БЕТА - КАЗЕИНА НА ЕГО ШАПЕРОНОПОДОБНЫЕ СВОЙСТВА
5.1.Антиагрегационные свойства бета-казеина при тепловой денатурации алкогольдегидрогеназы (АДГ) и каталазы

(посттрансляционные модификации); каждая характеристика белка, таким образом, может быть видоизменена с помощью замещения, введения или делеции одной или множества аминокислот. Даже природа аминокислот и их положение влияет на физико-химические характеристики белка и может предполагать полную делецию или дупликацию целой части белка.
Генетические изменения в целях улучшения или модифицирования функциональных свойств пищевых белков требует знания взаимосвязи их структуры и функций. Эти взаимосвязи, на данный момент, широко исследуются и позволяют предположить некоторое количество модификаций, намеренных улучшить свойства каждого типа казеина [Richardson et al., 1992; Gangnard et al., 2007, Gaudin et al., 2009].
Дуплицирование фосфорилированной части белка, при добавлении ее фрагмента в С-концевую область, способствует повышению фиксации кальция и амфифильных свойств казеина, что важно для его свойств в качестве стабилизатора эмульсий. С этой же целью авторы Holt и Sawyer [1988] заместили глутаминовую кислоту в положении 36 и 37 валином для амплификации гидрофобного участка амфифильной спирали.
Simons и соавторы [1993] получили мутанты бета-казеина, у которых был подавлен основной сайт расщепления фермента - химозина, который, в процессе созревания сыра, отщепляет С-концевой фрагмент (193 - 209) белка, отвечающий за появление вкуса свойственного сыру [Simons et al., 1993].
Мутация, состоящая во введении дополнительного сайта гликозилирования в положение 68, и нацеленная на амплификацию гидрофильной N-концевой части белка была проведена Choi и соавторами [2001 А, 2001 Б]. Мутант бета-казеина, продуцированный в дрожжах Pichia pastoris, содержал олигосахарид - маннозу, связанный с полипептидной цепью. Тот же мутант, экспрессированный в молоке трансгенной мыши, имел олигосахарид гетерогенной природы. Посттрансляционное гликозилирование аспарагинового остатка в положении 68, повышало полярность N-концевой области бета-казеина, растворимость и способность