Изучение новой сигнальной функции оксида азота - регуляции экспрессии гена aidB Ada-регулона Escherichia coli

• Автор: Стрельцова, Дарья Александровна
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 106 с. : ил.

Содержание
Введение
Глава ]. Обзор литературы
1.1. Алкилирование в биологии
1.1.1 .Типы алкилирующих агентов
1.1.2. Бифункциональные и монофункиональные агенты
1.1.3. SnI Sn2 нуклеофильные замещения
1.1.4. Мишени и биологические последствия
алкилирования ДНК
1.2. Защита клетки E.coli от алкилированных
повреждений ДНК. Адаптивный ответ
1.3. Сигнальные функции оксида азота
в E.coli и динитрозильные комплексы железа
1.4. Основной механизм регуляции анаэробного метаболизма
в E.coli. Белок Fnr[4Fe-4S]2+
1.4.1. Модели сборки
[4Fe-4S]2+ кластера белка Fnr in vitro
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Бактериальные штаммы и питательные среды
2.2. Оценка клеточного роста
2.3. Анаэробная инкубация E.coli
2.4. Экспрессия генов-репортеров
2.5. Синтез NO-доноров
2.6. Измерение NO-донирующей активности NO-доноров
2.7. Определение цитотоксической активности NO-доноров
2.8. Электронный парамагнитный резонанс

2.9. Определение продуктов распада железо-серных кластеров [4Fe-4S]2+ в клеточных образцах
2.10. Изучение избирательности к источникам серы для
сборки кластера [4Fe-4S]2+ в клетках E.coli
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Взаимосвязь NO-донирующей и биологической активности изученных доноров оксида азота
3.2. Кинетика экспрессии гена E.coli aidB в аэробных и анаэробных условиях культивирования
3.3. Избирательное ингибирование экспрессии гена E.coli aidB оксидом азота в анаэробных
условиях культивирования
3.4. Изучение зависимости экспрессии гена aidB от структуры железо-серного кластера
Fnr[4Fe-4S]2+ в E.coli
3.5. Изучение механизма конверсии [4Fe-4S]2+ кластера
при взаимодействии с N
3.6. ЭПР-исследование механизмов нитрозилирования и реконструкции железо-серного кластера
Fnr[4Fe-4S]2+ в E.coli
3.7. ДНКЖ с персульфидными лигандами и реконструкция [4Fe-4S]2+ кластеров в Fnr E.coli. Источники железа и серы в механизме реконструкции Fe-S кластеров E.coli in vivo
Глава 4. Заключение
Выводы
Список сокращений
Список литературы

Введение
Актуальность работы. ДНК-репарациоиные системы - основные защитные механизмы клеток, сформировавшиеся в ходе эволюции и сохранившиеся общими, либо подобными для разных биосистем. История изучения репарации ДНК берет начало в пионерских работах середины XX века с использованием бактериальной клетки, а в качестве агентов воздействия на клеточную ДНК - факторов физической природы (УФ- и ионизирующее излучение) [1, 2]. Первым изученным механизмом репарации ДНК стал феномен ферментативной фотореактивации — процесс, в котором фермент ДНК-фотолиаза напрямую восстанавливает индуцированные УФ-излучением тиминовые димеры в ходе фотохимической реакции [3]. В середине 1960-ых американскими исследователями была описана независимая от видимого света эксцизионная репарация (контролируемая опероном UvrABC) в клетках Escherichia coli, экспонированных УФ-облучешпо [4, 5]. Практически одновременно это открытие было повторено на клетках млекопитающих [6]. Исследования, проведенные в последующее десятилетие, позволили сделать вывод о наличии в клетке альтернативных систем эксцизионной репарации нуклеотидов и эксцизионной репарации оснований ДНК [7-10]. Вместе с фундаментальными открытиями расширялось представление о роли адекватной работы ДНК-репарационных систем в поддержании целостности генотипа, а также опухолевой трансформации клеток [И, 12]. К концу 1970-х научное знание о механизмах репарации ДНК основывалось на двух принципах: эксцизия повреждения ДНК либо прямой возврат к незамещенной форме основания. Прогрессом в этой области исследований стало открытие систем пострепликативной репарации ДНК для преодоления повреждений, остающихся в ДНК [13]. Важнейшим вкладом в изучение репарации ДНК стала сформированная М. Радианом гипотеза о

Таблица 1.
Генотипы штаммов Е.соИ, использованные в экспериментальных исследованиях
Штамм Генотип
MV2176 (A(argF-lacZ)205(U169) rfa-550 [aic/B: :lacZ] argE3 his-4 leu-6proA2 thr-I ara-14thr-I ara-14 galK2 lacYl mtl-i xyl-5 thi-J rpsL31 supE44 tsx-33)
МС4100 wt F- [araDl39]B/r A(argF-lac)l69 &lambda- el4-flhD5301 A(fruK-yeiR)125 (fruA25) relAl rpsLl50(strR) rbsR22 A(fimB-fimE)632(::IS1) deoCl
МС4100 [soxSr.lacZ] MC4100 wt/pTN 1530 Ampr
МС4100 AiscA MC4100 wt AiscA - делеция iscA гена, кодирующего белок-транспортер клеточного железа на платформу сборки IscU (iscRSUA регулон)
МС4100Л sufA МС4100 wt F2 A(lacZYA-argF) Ul69 rpsl À(soxS'-lacZ)sufA -делеция sufA гена, кодирующего железо-связывающий белок-транспортер клеточного железа на платформу сборки IscU (sufABCDSE регулон)
MC4100 AiscA/AsufA [soxS::lacZ МС4100 wt/pTNI530 Ampr AiscA AsufA - двойная делеция iscA и sufA генов-паралогов
E.coli TN530 [soxS::lacZ F2 A(lacZYA-argF) Ul 69 rpsL X(soxS'-lacZ) soxRS*
E.coli TN531 [soxSr.lacZ] TN530 A{soxRS-zjc2204) zjc2205::Tnl0Km
PQ37 sfiA::lacZ uvrA (sfiA::Mud (APlac) cts lac AU169 mal+uvrA galE galY PhoG rda F- thr leu hispyrD thi trp::Muc+srl300::TnlO)