Исследование роли разобщающих белков (UCP) и других митохондриальных белков-переносчиков в терморегуляторном разобщении дыхания митохондрий печени и скелетных мышц сусликов (Spermophilus undulatus)

• Автор: Комелина, Наталья Павловна
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 125 с. : ил.

Оглавление
Введение

Глава Г. Обзор литературы

1. Роль протонных утечек рассеивающих АрН* на внутренней мембране

митохондрий и снижающих эффективность окислительного фосфорилирования.

1.1. Не сопряженное с фосфорилированием, свободное, дыхание в митохондриях и его возможные функции.

1.2. Механизм разобщающего действия жирных кислот.

2. Белки внутренней мембраны митохондрий, принимающие участие в

разобщающем действии жирных кислот.

2.1. АТР/АОР антипортер как разобщающий белок.

2.2. Аспартат/глутаматный переносчик как разобщающий белок.

2.3 Другие белки, участвующие в транспорте жирных кислот.
3. Разобщающий белок митохондрий бурой жировой ткани (ГГСР1).
3.1. Особенности митохондрий бурой жировой ткани.
3.2. Структура разобщающего белка.
3.3. Модели функционирования разобщающего белка.
4. Тканевые гомологи разобщающего белка;(ГГСР).
4.1. История открытия гомологов ГГСР.
4.2. Распространение белков семейства ГГСР в различных тканях. -
4.3. Биохимические свойства белков иСР2 и иСРЗ.
4.3.1. Активаторы и ингибиторы ИСР2 и 11СРЗ.
4.3.2. Механизм разобщения для иСР2 и ИСРЗ. :
4.4. Регуляция экспрессии генов ГГСР.
4.5. Предполагаемые функции ГГСР2 и ГГСРЗ.
4.5.1. иСР2 и ИСРЗ увеличивают термогенез.
4.5.2. ГГСРЗ участвуют в метаболизме жирных кислот.
4.5.3. иСР защищают от образования активных форм кислорода.
4.5.4. иСР2 регулирует секрецию инсулина.
4.5.5. ГГСР2 вовлечен в процесс апоптоза.
4.5.6. ГГСР2 и ИСРЗ связаны с транспортом Са2
4.5.7. ГГСР2 переключает метаболизм с углеводного на жировой.
4.5.8. иСР2 является маркеров макрофагов.
4.6. Особенности белков 11СР4 и иСР5.
4.7. Эволюция семейства 11СР и распространение среди видов.
4.7.1. Распространение ГГСР в различных систематических группах живых организмов.
4.7.2. Филогенез семейства ГГСР.
5. Зимняя спячка (гибернация) млекопитающих. Особенности
физиологии и метаболизма;
5.1. Подавление метаболизма в состоянии гибернации.
5.2. Подавление функциональной активности митохондрий гибернирующих животных.
5.3. Активация окислительной активности митохондрий при выходе из

состояния гибернации.
5.4. Адаптации на молекулярном уровне.
5.5. Исследования белков UCP у гибернирующих животных. ,
Глава 2. Материалы и методы исследования.
2.1. Объекты исследования.
2.2. Выделение митохондрий из бурой жировой ткани, печени и скелетных 54 мышц.
2.3. Полярографический метод определения поглощения кислорода 55 суспензией митохондрий с помощью электрода Кларка.
2.4. Определение трансмембранного потенциала на внутренней мембране 55 митохондрий методом синтетических проникающих ионов с помощью
ТРР~ электрода.
2.5. Метод генерации супероксида с помощью системы ксантин плюс 56 ксантиноксидаза.
2.6. Анализ кинетических параметров конкурентного и неконкурентного 57 ингибирования.
2.7. Определение изменений объема митохондрий по светорассеиванию. ■
2.8. Определение концентрации белка по методу Лоури.
2.9. Экстракция белков с помощью детергентов.
2.10. Разделение белков на колонке с гидроксилапатитом.
2.11. Г ель-фильтрация на сефадексе.
2.12. Диск-электрофорез белков в градиенте пористости ПААГ.
2.13. Выделение ДНК методом депротеинизации щелочным фенолом.
2.14. Выделение РНК из тканей.
2.15. Подбор праймеров для обратной транскрипции и PCR анализа.
2.16. Реакция обратной транскрипции.
2.17. RT-PCR в реальном времени.
2.18. Экстракция фрагментов ДНК из ПААГ.
2.19. Статистическая обработка данных.
Глава 3. Результаты и их обсуждение.
3.1. Участие UCP2, аспартат/глутаматного переносчика и ATP/ADP антипоргера в разобщении, индуцированном свободными жирными кислотами, в митохондриях печени зимних активных сусликов.
3.1.1. Исследование ресопрягающих эффектов GDP, глутамата и cAtr на скорость дыхания митохондрий печени зимних активных сусликов.
3.1.2. Исследование ресопрягающих эффектов GDP, глутамата и cAtr на мембранный потенциал митохондрий печени зимних активных сусликов.
3.1.3. Действие супероксида на параметры дыхания митохондрий печени зимних активных сусликов и ресопрягающие эффекты GDP и cAtr.
3.1.4. Действие супероксида на величину мембранного потенциала митохондрий печени суслика и ресопрягающие эффекты GDP и cAtr.
3.1.5. Исследование параметров дыхания митохондрий легких, выделенных
из зимних активных сусликов.

3.1.6. Заключение к главе 3.1.
3.2. Участие UCP3 и ATP/ADP антипортера в разобщении, индуцированном свободными жирными кислотами, в митохондриях скелетных мышц сусликов.
3.2.1. Сравнение параметров дыхания митохондрий скелетных мышц активных и гибернирующих сусликов.
3.2.2. Исследование мембранного потенциала митохондрий скелетных мышц активных и гибернирующих сусликов.
3.2.3. Заключение к главе 3.2.
3.3. Участие разобщающих белков UCP2 и UCP3, аспартат/глутаматного переносчика и ATP/ADP антипортера в терморегуляторном увеличении скорости дыхания митохондрий печени и скелетных мышц сусликов, пробуждающихся из состояния зимней спячки.
3.3.1. Сравнение параметров дыхания и мембранного потенциала митохондрий печени и скелетных мышц активных и просыпающихся сусликов, и действие пуриновых нуклеотидов,
cAtr и глутамата.
3.3.2. Заключение к главе 3.3.
3.4. Анализ взаимодействия различных нуклеотидов с ATP/ADP — антипортером по кинетике его влияния на скорость фосфорилирующего дыхания митохондрий в стационарном состоянии.
3.4.1. Кинетика влияния GDP на скорость фосфорилирующего дыхания митохондрий в стационарном состоянии.
3.4.2. Исследование ингибирования ATP/ADP антипортера различными нуклеотидами.
3.4.3. Заключение к главе 3.4.
3.5. Хлорная проводимость, обусловленная присутствием UCP в митохондриальной мембране, и ее чувствительность к GDP и cAtr.
3.5.1. Хлорная проводимость и ее чувствительность к GDP в митохондриях бурого жира, скелетных мышц и печени зимних активных сусликов.
3.5.2. Хлорная проводимость и ее чувствительность к cAtr в митохондриях бурого жира.
3.6. Выделение разобщающего белка и его гомологов методом адсорбционной хроматографии и их идентификация методом диск-электрофореза в градиенте пористости ПААГ с использованием SDS.
3.7. Дифференциальная активность генов, кодирующих UCP2, UCP3 и
ANT в тканях печени и скелетных мышц сусликов.
3.7.1. Уровень экспрессии мРНК UCP2, UCP3 и ANT в печени.
3.7.2. Уровень экспрессии мРНК UCP2, UCP3 и ANT в скелетных мышцах.
Заключение
Выводы
Список литературы
Список сокращений
Список публикаций

осуществляющего сопряжение процессов окисления глюкозы (гликолиза) и митохондриального метаболизма (Pecqueur et al., 2009).
Анализируя результаты экспериментов, получение за последние несколько лет авторы пришли к заключению, что новые разобщающие белки UGP' (гомологи UCP1) следует считать митохондриальными переносчиками, а не разобщающими белками. Гипотеза о том, что UCP2 действуют как регуляторы окисления ЖК в митохондриях, согласуются с предыдущими исследованиями, показывающими что UCP2 играет роль в метаболизме липидов, осуществляя переключение между углеводным и липидым метаболизмом, например во время голодания или транспортируя ЖК из митохондрий (см. Cannon, Nedergaard, 2006).
Glucose
Гч'ЛОН
ATP’—~"Ä

K’ADPH
Pentose
Phosphate
Pathway

AcylCoA

Glutamine
Membrane
Рис.9. В зависимости от доступности питательных веществ, глюкозы или жирных кислот, клетка регулирует метаболизм митохондрий и использует или гликолиз, или окислитеное фосфорилирование для получения энергии. При отсутствии 11СР2, клетка перюиочается на использование глюкозы, что стимулирует пролиферацию. Увеличение экспрессии иСР2 (например, при голодании), коррелирует с возрастанием окисления жирных кислот, при этом лимитируется использование пирувата, образуемого в процессе гликолиза. Экспорт пирувата из митохондрии в цитозоль через иСР2 может обеспечивать наблюдаемые эффекты (Ресцисиг й а!., 2009).
В результате проведенных экспериментов, авторы заключили, что 11СР2 является переносчиком, экспортирующим пируват из митохондрий. Тем более, что ранее было показано, что 11СР1 в митохондриях БЖТ способен транспортировать пируват (.Гегек, Вогеску, 1998; 1ехек, ОагПб, 1990). В отсутсвие 11СР2 пируват аккумулируется внутри митохондрий и обуспечивает достаточное количество интермедиатов для цикла Кребса, в результате окисление жирных кислот или глютамина снижается. В зависимости от физиологических условий, экспрессии и активации JCP2 процесс утилизации пирувата может или стимулироваться или лимитироваться. Например, при голодании, когда липолиз увеличивается, зафиксированное при этом увеличение экспрессии ИСР2 позволяет клетке сберегать глюказу, а в качестве основного биоэнергетического субстрата для митохондрии использовать жирные кислоты. Наоборот, в раковых клетках, где высокий гликолитический метаболизм может превышать максимальную скорость работы пируват-дегидрогеназы, увеличение экспрессии иСР2 позволит избежать накопления пирувата в митохондриях. При этом различные способы