Изучение клеточной функции транскрипционного фактора E. coli GreA

• Автор: Степанова, Екатерина Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.28
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 132 с. : ил.

Список сокращений
РНКП РНК-полимераза
п-кд ІМ-концевой домен
с-кд С-концевой домен
ПЗУ положительно заряженный участок
дт дикий тип
ПРП полноразмерный РНК-продукт
нт нуклеотид
ЭК элонгационный комплекс
№Т рибонуклеотидтрифосфаты
АТР аденозинтрифосфат
СТР цитидинтрифосфат
СТР гуанозинтрифосфат
итр уридинтрифосфат
ТБ транскрипционный буфер
ПА АГ полиакриламидный гель
э/ф электрофорез

Содержание
I. Литературный обзор
Введение
ІЛ Общие сведения об РНК-полимеразах прокариот
1.2 Транскрипционные факторы GreA и GreB
1.3 Регуляция факторами, взаимодействующими с РНКП через 27 вторичный канал
Структура и функции эукариотического аналога Gre
транскрипционного фактора TFIIS
Структура и функции транскрипционного фактора Gfhl
гомолога Gre
Структура и функции транскрипционного фактора DksA
Структура и функции транскрипционного фактора Rnk
Структура и функции транскрипционного фактора TraR
Заключение
II. Материалы и методы
II. 1 Синтетические ДНК олигонуклеотиды, использованные в
работе
11.2 Штаммы, использованные в работе
11.3 Плазмиды, использованные и полученные в работе
11.4 Питательные среды
11.5 Антибиотики
11.6 Ферменты в молекулярном клонировании
11.7 Электрофорез
11.8 Выделение РНК
11.9 Выделение ДНК
II. 10 Выделение и очистка белков
II. 11 Иммуноблоттинг
II. 12 Приготовление компетентных клеток и трансформация
бактерий
II. 13. Исследование экспрессии на микрочипах
II. 14. Обратнотранскриптазная реакция достройки праймера
II. 15 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
11.16. Секвенирование ДНК
II. 17. Получение ДНК матриц для транскрипции in vitro
II. 18 Получение пДНК матриц для перманганатного
футпринтинга
II. 19. Реакции транскрипции in vitro
11.20. Футпринтинг
11.21 Анализ активности репортёрного белка ß-галактозидазы
11.22 Программы, использованные в работе
III. Результаты и обсуждение
III. 1. Сравнение экспрессионных профилей клеток E. coli AgreB

и AgfeAAgreB
111.2. Проверка данных экспрессионных микрочипов с помощью реакции достройки праймеров для ряда генов
111.3. Функциональный анализ данных экспрессионных микрочипов с помощью компьютерной обработки
111.4. Анализ механизма регуляции фактором GreA с помощью in vitro транскрипции
111.5. Характеристика коротких РНК-продуктов траснкрипции на промоторах генов отрХ и rplN
111.6. Характеристика конформации тупиковых ЭК, образованных на РrplN и РотрХ
111.7. Характеристика тупиковых ЭК, образованных на промоторах Prp/N и РотрХ in vivo
111.8. Изучение механизма образования тупиковых комплексов на PrplN и РотрХ
111.9. Поиск элементов промотора, вызывающих образование тупиковых комплексов
Выводы
Список литературы

у GreA, и несколько изменяется взаимное расположение прямых а-спиралей N-КД.
Анализ Tth GreA/Gfli 1-гибридов показал, что дистальная часть N-КД определяет тип активности гибридного белка: стимулирующий или
ингибирующий. Замена петли Gfihl, соединяющей две а-спирали N-КД (остатки 40-46 Gfhl Tth), на петлю GreA не приводит к возникновению транскрипт-расщепляющей активности у белка-гибрида и лишь незначительно снижает ингибирующую активность. Таким образом, при наличии двух кислых остатков Asp-41 и Glu-44 вместо четырёх GПі 1 сохраняет ингибирующую активность. Замена всех четырех кислых аминокислот на остатки аланина (мутант Gfhl-DA4) приводит к инактивации Gfhl как ингибитора. Тем не менее, даже такой мутант сохраняет остаточную способность подавлять синтез на стадии элонгации в условиях низких концентраций субстратов, и абортивный синтез при высоких концентрациях мутантного фактора. Таким образом, наличие двух кислых аминокислотных остатков в положениях 41 и 44 является необходимым и достаточным условием проявления высокой ингибирующей активности фактором Gfhl.
Модель механизма ингибирования РНКП фактором Gfhl основана на факте сильной зависимости ингибирующего эффекта Gfhl, но не Gfhl-DA4, от концентрации ионов Mg2 . Предполагается, что в комплексе с РНКП остатки Asp Gfhl, расположенные в петле, вступают в прямую конкуренцию с субстратами за координацию иона Mg2+ II. Вероятно, геометрия комплекса