Выделение, ферментативные и антибиотические свойства природных микроорганизмов и оценка их биотехнологического потенциала

• Автор: Андреева, Ирина Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 149 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
БИОРАЗНООБРАЗИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ - ИСТОЧНИК ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДУЦЕНТОВ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ (БАВ)
1.1. Основные направления в использовании микроорганизмов и продуктов их

жизнедея тельности в науке и народном хозяйстве
1.2. Особенности и преимущества микроорганизмов экстремальных условий обитания в качестве продуцентов биологически активных веществ
1.3. Сайт-специфические эндонуклеазы рестрикции (ЭР) - энзимологический инструментарий молекулярной биологии
1.4. Микроорганизмы в процессах деградации и трансформации веществ
1.5. Антагонистическая активность микроорганизмов
1.6. Инсектицидная активность микроорганизмов
1.7. Антимикробная активность штаммов Bacillus thuringiensis 30 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Источники отбора образцов для выделения микроорганизмов
2.2. Методы выделения и идентификации микроорганизмов
2.3. Условия культивирования шгаммов-продуцентов БАВ
2.4. Определение наличия и специфичности ЭР в штаммах микроорганизмов
2.5. Скрининг микроорганизмов на продукцию полнсахаридшдролаз
2.6. Геномный анализ штаммов микроорганизмов
2.7. Анализ профиля жирных кислот
2.8. Идентификация, определение инсектицидной и антимикробной активностей штаммов Bacillus thuringiensis (Bt)
2.8.1. Определение инсектицидной активности штаммов В1
2.8.2. Определение антимикробных свойств водорастворимых метаболитов

штаммов Bt
2.8.3. Определение антимикробной активности растворенных дельта-эидотоксинов

2.8.4. Определение противовирусной активности штаммов В1
2.8.5. Определение состава белков параспоральных включений штаммов В1
2.9. Определение патогенности штаммов микроорганизмов
2.10. Хранение и поддержание штаммов
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
ГЛАВА. 3. РАЗНООБРАЗИЕ И ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПРИРОДНЫХ ИСТОЧНИКОВ
3.1. Разнообразие, ферментативная активность микроорганизмов, выделенных из образцов почвы, воды и осадков Долины гейзеров (Камчатка)

3.2. Разнообразие, ферментативная и антибиотичекая активность мпкроорга-

низмов аэрозолен воздуха
3.3. Психрофильные бактерии льда Антарктиды, выделение, идентификация, ферментативная активность
3.4. Разнообразие и ферментативная активность микроорганизмов, выделенных из образцов осадков глубокого бурения дна оз. Байкал
3.5. Новые виды микроорганизмов, выделенные из природных образцов
3.5.1. Грамотрнцательные, образующие эндоспоры, бактерии рода Paenibacil-
lus, выделенные из почвы и источников Долины гейзеров
3.5.2. Образующая эндоспоры грамотрицательная эубактерня Brevibacilltts barguzinii sp. nov., выделенная из термального источника gg
3.5.3. Roseomonas baikalica sp. nov. - новый вид микроорганизма, выделенного
из образца керна глубокого бурения дна озера Байкал
ГЛАВА 4. ВЫДЕЛЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ-ПРОДУЦЕНТОВ ЭНДОНУКЛЕАЗ РЕСТРИКЦИИ (ЭР)
4.1. Штамм Paenibacillus sp. Dg-1009 - продуцент изошизомера ЭР Psp 10091, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-GCCNNNNNGGC -3’
4.2. Азотофиксирующие микроорганизмы рода Rhizobium, продуценты ЭР
4.2.1. Идентификация штаммов, скрининг на наличие ЭР
4.2.2. Штамм R.legwninozarum R-69, продуцент ЭР Rie
4.2.3. Штамм R. trifolii R-63, продуцент ЭР RtrI
4.2.4. Штамм R. meliloti 21, продуцент ЭР Rme21I

4.2.5. Штамм R. trifolii 20, продуцент ЭР Rtr20I
4.3. ВтеЗбП — новая сайт-специфическая ЭР II типа из штамма Bacillus megaterium
4.4. Психрофильный штамм Acinetobacter sp. ОК-ЮЗр - продуцент ЭР
Asp 1031, узнающей нуклеотидную последовательность 5’- GGATCC-3’
4.5. Штамм Klebsiellae pneumoniae 378- продуцент ЭР Крп3781
4.5.1. Идентификация штамма К. pneumoniae 378, определение специфичности

4.5.2. Селекция штамма К. pneumoniae 378 по технологически важным признакам
4.6. Штаммы термофильных бактерий вида Bacillus stearothermophilus - продуценты изошизомеров ЭР BstEIl и BsiYI
4.6.1. Штаммы В. stearothermophilus Т-10 и Т-9 - продуценты изошизомера ЭР BstEIl
4.6.2. Штамм В. stearothermophilus Т-22 - продуцент изошизомера ЭР BsiYI. 102 ГЛАВА 5. АНТИМИКРОБНАЯ И ИНСЕКТИЦИДНАЯ АКТИВНОСТИ СПОРООБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ ВИДА BACILLUS THURINGIENSIS
5.1. Идентификация и биотестирование штаммов Bt, выделенных из аэрозолей воздуха и осадков Байкала
5.2. Атипичные штаммы Bt, выделенные из почвы, воды и осадков горячих источников Долины Гейзеров
5.2.1. Идентификация штаммов
5.2.2. Антимикробная активность штаммов
5.2.3. Противовирусная активность штаммов
5.2.4. Гепотипирование штаммов ] ]б
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ
ПРИЛОЖЕНИЕ
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ
ИФБ - институт фармацевтической биотехнологии , г.Степногорск, Казахстан ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

При изучении биохимических свойств выясняли способность штаммов к утилизации различных источников углерода, к образованию уреазы, каталазы и оксидазы, индола, сероводорода, ацетоина, к восстановлению нитратов, к гидролизу казеина, желатина, крахмала, деградации тирозина, дезаминированию фенилаланина, определяли другие дифференцирующие признаки в соответствии с определителями бактерий (Ilolt et al., 1986.; Хо-улт, 1997).
Скрининг штаммов на липолитическую активность проводили с использованием агаризованной среды LB, содержащей 1% Твин-20, Твин-40 или Твин-80, с добавлением 0,01% СаСЬ (Герхард и др., 1983, 1984). Относительную активность фермента устанавливали по соотношению размеров диаметра колонии и диаметра зоны проявления липолити-ческой активности.
Обнаружение щелочной фосфатазы. С использованием суточной культуры готовили густую суспензию клеток в физиологическом растворе (0,85% NaCl). 0,3 мл суспензии добавляли к 0,3 мл раствора субстрата, содержащего 0,04 М глициновый буфер, pli 10,5, и 0,01 М динатрий-п-нитрофенилфосфат («Sigma»). Реакционную смесь инкубировали в течении 3-х часов при температуре 37 С. Активность ферментов определяли на планшетном фотометре «Униплан» (Россия) со светофильтром с длиной волны 405 нм (Герхард и др., 1983, 1984). Контролем служила реакционная смесь без внесения культуры.
Определение экзонуклеазной активности. Исследуемые культуры высевали на плотную среду с тимусной ДНК и толуидиновым синим. Наличие положительной реакции учитывали по появлению ярко-розовой зоны вокруг бактериальной колонии (Герхард и др., 1983, 1984).
2.3. Условия культивирования штаммов-продуцентов БАВ
Штаммы культивировали на термостатированой качалке (КТ 104, Россия) с использованием питательных сред: LB (Difco), ПС-1 (пептон - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 5 г/л, NaCl - 10 г/л) и ПС-2 (гидролизат кильки - 35 г/л, автолизат дрожжей - 5 г/л), среды BSPR (пептон (Difco) - 20 г/л, дрожжевой экстракт (Difco) - 10 г/л, К2НРО4 - 2 г/л, NaCl -5г/л, MgS04x7H20 - 2 г/л, глюкоза до 1%), а также, среды ПС-3 с увеличенным содержанием дрожжевого экстракта (пептон - 10 г/л, др. экстракт - 10 г/л, NaCl - 5г/л). Значение pH всех сред составляло 7,0-7.2, при необходимости к среде культивирования добавляли глюкозу до 1%. Агаризованые и жидкие питательные среды засевали используя ипокулят с концентрацией клеток 1-5хЮ9 кл/мл. Режим аэрации, время и температуру культивирования подбирали для каждой культуры индивидуально. Интенсивность роста штаммов в жидких питательных средах определяли по оптической плотности (ОП) культуральной