Роль сенсорных РНК в регуляции биосинтеза рибофлавина у Escherichia coli и Bacillus subtilis

• Автор: Еремина, Светлана Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 118 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы
Цели и задачи исследования
Научная новизна и практическая значимость работы б
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1 Генетический контроль биосинтеза рибофлавина у микроорганизмов
1.1 Флавиногенез у микроорганизмов
1.2 Гены флавиногенеза у микроорганизмов
1.2.1 Гены биосинтеза рибофлавина у В. subtilis и E. coli
1.2.2 Г ены флавокиназы/ФАДсинтазы и флавокиназы у В. subtilis
1.3 Регуляция экспрессии генов рибофлавинового оперона у В. subtilis
Глава 2 Регуляция экспрессии генов с помощью сенсорных РНК
2.1 Механизмы регуляции экспрессии генов у прокариот
2.2 Классификация сенсорных РНК
2.3 Особенности регуляции оперона биосинтеза рибофлавина
2.4 Тиаминпирофосфат-связывающая сенсорная РНК
2.5 Аденозилкобаламин-связывагощая сенсорная РНК
2.6 Регуляция метаболизма аминокислот с помощью сенсорных РНК
2.6.1 S-аденозилметионин-связывающая сенсорная РНК
2.6.2 Лизин-связывающая сенсорная РНК
2.6.3 Глицин-связывающая сенсорная РНК
2.7 Пурин-связывающие сенсорные РНК
2.8 Глюкозамин-6-фосфат-связывающая сенсорная РНК
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 3 Материалы и методы
3.1 Бактериальные штаммы, плазмиды и среды
3.2 Генно-инженерные методы
3.3 Конструирование рекомбинантных плазмид
3.4 Манипуляции с РНК

Глава 4 Исследование регуляции рибофлавннового оперона Bacillus subtilis
4.1 Клонирование и определение нуклеотидной последовательности лидерной
области п'й-оперона В. subtilis
4.2 Компьютерный анализ вторичной структуры лидерной мРНК п'6-оперона
В. subtilis
4.3 Сайт-направленный мутагенез лидерной области п'Ь-оперопа В. subtilis
4.4 Клонирование мутаций в лидерной области п'й-оперона в составе экспрессионного вектора pDG268 и их интеграция в хромосому В. subtilis
4.5 Изучение экспрессии транскрипционных фьюзов ribPL-lacZ в клетках
штаммов В. subtilis различного генотипа
4.6 Транскрипция лидерной мРНК гг'й-оперона дикого типа и ее мутантных
вариантов в системе in vitro
4.7 Опыты по гибридизации специфических олигонуклеотидов с лидерной
мРНК пй-оперона
Глава 5 Исследование регуляции гена ribB Escherichia coli
5.1 Первичная характеристика гена ribB E. coli
5.2. Клонирование лидерной области гена ribB
5.3 Определение сайта инициации транскрипции лидерной области гена ribB
5.4 Компьютерный анализ вторичной структуры лидерной мРНК гена ribB E. coli
5.5 Сайт-направленный мутагенез лидерной области гена ribB
5.6 Изучение экспрессии транскрипционных и трансляционных фьюзов
ribB-lacZ в клетках E. coli
5.7 Опыты in vitro по идентификации эффекторов сенсорной РНК гена ribB
5.8 Влияние флавинов на формирование 308-инициаторного комплекса
на лидерной мРНК гена ribB
ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ФМН - флавинмононуклеотид
ФАД - флавинадениндинуклеотид
ГТФ - гуанозин-5'-трифосфат
НАД - никотинамидцинуклеотид
НАДФ - никотинамиддинуклеотидфосфат
Риб - рибофлавин
ТПФ - тиаминпирофосфат
GIcN6P - глюкозамин-6-фосфат
SAM - S-аденозидметионин
Ado-Cbl - аденозилкобаламин
Bgl - семейство ферментов, участвующих в метаболизме Р-глюкозидов TRAP - триптофан-РНК-связывающий аттенюирующий белок
SD-последовательность - последовательность Шайна-Дальгарно, сайт связывания с рибосомой G - гуанин А - аденин Н - гипоксантин
мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота
тРНК - транспортная рибонуклеиновая кислота
ПЦР - полимеразная цепная реакция
п.н. - пара нуклеотидов
ГТААГ - полиакриламидный гель

оперона. Эта гипотеза получила экспериментальное подтверждение в последующих работах, которые привели к открытию нового механизма регуляции генов с участием сенсорных РНК [1,87]. В итоге проведенных исследований был сделан вывод, что лидерная мРНК ггй-оперона выступает в качестве сенсора специфических метаболитов -ФМН и ФАД и напрямую без белковых посредников регулирует транскрипцию структурных генов оперона. Кроме того, было показано, что гомологичный rfn-элемент, расположенный перед геном ураА В. subtilis, контролирующий транспорт рибофлавина в клетку, также функционирует как ФМН-связывающая сенсорная РНК [87].
В отличие от В. subtilis, при компьютерном анализе нуклеотидных последовательностей регуляторных участков rib-генов E. coli было выявлено присутствие r/й-элемента лишь перед одним геном - НЪВ, который кодирует синтез фермента 3,4-дигидрокси-2-бутанон-4-фосфатсинтазы [80]. Согласно предварительным данным, лидерная область гена ribB кодирует сенсорную РНК, которая по своей структуре похожа на сенсорную РНК r/6-оперона В. subtilis, но, в отличие от последней, не содержит Rho-независимого терминатора транскрипции [1].
2.4 Тиаминпирофосфат-связывающая сенсорная РНК
Тиамин, или витамин Bi, является предшественником тиаминпирофософата (ТПФ), который выступает кофактором основных ферментов углеводного метаболизма (Рис. 9). Регуляция тиаминовых генов детально изучена у E. coli, R. elti, S. typhimunum и В. subtilis. В большинстве случаев экспрессия тиаминовых генов негативно регулируется тиамином и ТПФ [20, 79, 88, 89].
8|C'Yi
-СЭз НМ.
CJfc C8j
thiamin TPP
Рисунок 9. Структура тиамина, ТПФ и их ферментативное превращение.
При детальном изучении нетранслируемых лидерных мРНК тиаминовых оперонов, регулирующихся по принципу обратной связи (thiCEFSGH, thiMD и sfuABC у E. coli), обнаружили эволюционно консервативную область длинной 39-нуклеотидов, получившую наименование thi-элемент [90]. Филогенетический сравнительный анализ показал, что последовательности всех /йг-элементов у различных родов бактерий формируют сходные шпилечные структуры [79, 91].