Выделение и характеристика пероксисомдефицитных мутантов метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha

• Автор: Курбатова, Елена Михайловна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 121 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Метаболические пути метилотрофных дрожжей, связанные с образованием пероксисом
1.1. Метаболизм метанола
1.2. Метаболизм метиламина у Натепи1а ро1утогрЪа
Глава 2. Пероксисомы, их строение и функции
2.1. История открытия и основные функции пероксисом
2.2. Выделение пероксисомных мутантов и клонирование РЕХ - генов
2.3. Транспорт пероксисомных белков
2.4. РТ81 транспорт матриксных белков
2.5. РТБ2 транспорт белков матрикса
2.6. Транспорт мембранных белков
2.7. Формирование пероксисом
2.8. Деление пероксисом
2.9. Гомеостаз пероксисом у Я. ро1утогр]га
2.10. Деградация пероксисом у метилотрофных дрожжей
2.11. Общие этапы биогенеза пероксисом и макропексофагии у Я ро1утогрИа
2.12. Участие пероксисом в программах дифференцировки клеток
2.13. Болезни человека, связанные с нарушением биогенеза пероксисом
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 3. Материалы и методы
3.1. Штаммы микроорганизмов, использованные в данной работе
3.2. Состав сред
3.3. Условия культивирования
3.4. Молекулярно - генетические методы
3.4.1. Методы генетики Я ро1утогрка
3.4.2. Общие методы
3.5. Плазмиды, использованные в работе
3.6. Клонирование генов
3.7. Световая и флуоресцентная микроскопия

3.8. Биохимические методы
3.8.1. Индукция пероксисомных ферментов
3.8.2. Получение бесклеточного экстракта
3.8.3. Определение активности ферментов
3.8.4. Определение концентрации белка
3.9. Методы компьютерного анализа
Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Получение и первичная характеристика мутантов
4.2. Общая характеристика мутантов
4.2.1. Определение фенотипа мутантов в условиях индукции биогенеза пероксисом на среде с метанолом
4.2.2. Определение рецессивности/доминантности мутаций
4.2.3. Идентификация мутантов при помощи делеционных рех-тестеров
4.2.4. Изучение “множественных” мутантов
4.2.5. Изучение “одиночных” мутантов
4.3. Цитологическая характеристика полученных мутантов методами флуоресцентной микроскопии
4.4. Определение количества групп комплементации среди
мутантов с дефектами пероксисом
4.5. Свойства мутанта N47
4.5.1. Фенотипические характеристики мутанта N47
4.5.2. Комплементация ростовых дефектов мутанта N47 геномной библиотекой и клонирование гена РЕХА
4.5.3. Определение нуклеотидной последовательности комплементирующего фрагмента и характеристика соответствующего белкового продукта
4.5.4. Определение внутриклеточной локализации белка РехАр Н. роїутогрка
4.5.5. Конструирование нулевой аллели гена РЕХ А
4.5.6. Определение активности ферментов метаболизма метанола у мутанта N47
4.6. Свойства мутанта N102
4.6.1. Фенотипические характеристики мутанта N102
4.6.2. Определение активностей пероксисомных ферментов метаболизма метанола и метиламина у мутанта N102

4.6.3. Клонирование гена, комплементирующего ростовой дефект у мутанта N102
4.7. Свойства мутанта N163
4.7.1. Фенотипические характеристики мутанта N163 и активности
ферментов первичного метаболизма метанола
4.7.2. Клонирование гена, комплементирующего ростовой дефект
у мутантаМ 63
Глава 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
5.1. Получение мутантов и их первичная характеристика
5.2. Комплементационный тест на аллелизм и селекция мутантов
методами флуоресцентной микроскопии
5.3. Изучение мутантов и клонирование новых генов
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

- В случае повторной комплементации мутантов, векторную вставку ДНК анализировали при помощи рестриктаз, а затем, для минимизации комплементирующего фрагмента, конструировали дополнительные плазмиды (Табл. 9). Минимальную вставку, содержащую ген, комплементирующий мутацию, секвенировали.
3.7. Световая и флуоресцентная микроскопия.
Морфологию дрожжевых клеток изучали с помощью микроскопа Zeiss Axioskop (Carl Zeiss, Gottingen, Germany), оборудованного CCD камерой фирмы Princeton Instruments (RTE/CCD-1300 Y, Princeton, The Netherlands). Локализацию содержащих eGFP гибридных белков определяли по описанному методу (Baerends et al., 2000).
Для приготовления препаратов клетки выращивали по следующим схемам:
-для скрининга большого количества мутантов, клетки, выращенные в пробирках с YPD в течение ночи, переносили в пробирки со свежей средой YPD, выращивали до поздней логарифмической фазы (ОПббо=5-5.5), для индукции пероксисом с eGFP переносили в пробирки с ММ, содержащей метанол, с последующим выращиванием при 45°С в течение 4-7 час.
- для изучения мутантов, представляющих специальный интерес, клетки выращивали в 100 мл флаконах, содержащих 25 мл среды ММ с 0.5% глюкозы до исчерпания субстрата в среде (обычно в течение ночи). 1-2 мл культуры переносили во флакон со свежей средой ММ с глюкозой и выращивали до достижения культурой плотности 1.2-1.6 (ОПббо). 1-2 мл выращенной таким образом культуры переносили во флакон с ММ, содержащей 0.5 % метанола. Клетки анализировали через 5-8 часов культивирования при 45°С.
-для изучения пероксисом сегрегантов, их клоны выращивали на чашках с YND при 37°С, переносили на чашки с YNM и анализировали после 7-10 часового культивирования при 45°С.
Клеточную суспензию (при необходимости, клетки разводили средой YNB) наносили на предметное стекло и изучали с помощью флуоресцентного микроскопа.