Молекулярно-биологические методы в диагностике хеликобактерной инфекции

• Автор: Махова, Мария Александровна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 140 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ЕЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1Л. Особенности хеликобактерной инфекции
1Л Л .Микробиологическая характеристика Helicobacter pylori
1.1.2. Факторы патогенности Helicobacter pylori
1.1.2.1. Уреаза
1.1.2.2. Продукт гена IceA
1.1.2.3. Вакуолизирующий цитотоксин
1.1.2.4. Остров патогенности Helicobacter pylori
1.1.2.5. Другие факторы патогенности
1.2. Эпидемиология инфекции Helicobacter pylori
1.3. Лабораторная диагностика хеликобактериоза
1.3.1. Бактериологический метод
1.3.2. Морфологическая группа методов
1.3.3. Быстрый уреазный тест
1.3.4. Уреазные дыхательные тесты
1.3.5. Серологический метод
1.3.6. Молекулярно-генетические методы
1.3.6.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Методики подготовки клинических проб к проведению ПЦР
2.1.1. Подготовка клинических проб к проведению ПЦР методом
кипячения
2.1.3. Подготовка клинических проб к проведению ПЦР методом, предложенным Марковой Г.А. и соавт. (1994) - полный вариант
2.1.4. Способы выделения ДНК из клинического материала, основанные на неферментативном лизисе исследуемого материала с последующим связыванием выделенной ДНК с сорбентом
2.1.4.1. Выделение ДНК с помощью набора «ДНК-сорб А»
2.1.4.2. Выделение ДНК с помощью набора «ДНК-сорб Б»
2.1.5. Методика выделения ДНК из парафинизированных срезов
2.2. Проведение ПЦР-амплификации фрагмента генома Helicobacter pylori
2.2.1. Проведение ПЦР-амплификации гена 16SpPHK Helicobacter
pylori с использованием тест-системы «Helicobacter»
2.2.2. Проведение ПЦР-амплификации гена 6SpPHK Helicobacter pylori
с использованием тест-системы «АмплиСенс-Helicobacter pylori-520»
2.2.3. Проведение ПЦР-амплификации гена UreC Helicobacter pylori с использованием тест-системы «Хеликопол И»
2.2.4. Проведение ПЦР-амплификации гена CagA Helicobacter pylori
с помощью тест-системы «ДиаГен-Helicobacter»
2.2.5. Проведение ПЦР-амплификации гена VacA Helicobacter pylori с использованием набора «Хеликопол VA»
2.3. Пост-ПЦР обработка продуктов амплификации с помощью
урацил-ДНК-гл икозил азы
2.4. Метод гетеродуплексного анализа фрагмента гена CagA Helicobacter pylori
2.5. Методы регистрации результатов
2.5.1. Электрофорез продуктов амплификации в агарозном геле
2.5.1.1. Приготовление агарозного геля
2.5.1.2. Проведение электрофореза в агарозном геле
2.5.1.3. Учет результатов
2.5.2. Электрофорез в полиакриламидном геле
2.5.2.1. Приготовление 10% полиакриламидного геля
2.5.2.2. Проведение электрофореза в 10% полиакриламидном геле

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Адаптация метода ПЦР для целей практической
клинической диагностики хеликобактерной инфекции
3.1.1. Подбор оптимального приборного обеспечения амплификации
3.1.2. Выбор метода обработки клинического материала
3.1.3. Апробация экспериментальных отечественных тест-систем
для ПЦР-детекции Helicobacter pylori
3.1.4. Антиконтаминационная защита проведения
ПЦР-детекции Helicobacter pylori
3.1.5. Введение внутреннего контроля ПЦР
3.2. Выявление Helicobacter pylori в различных типах биологического материала: биоптате слизистой оболочки желудка, желудочном
соке, фекалиях
3.3. Сопоставление результатов диагностики, полученных традиционными и молекулярно-биологическими методами
3.4. Выявление Helicobacter pylori у больных разных возрастных групп
с различными формами гастродуоденальной патологии
3.5. Разработка варианта ПЦР-детекции Helicobacter pylori, позволяющего оценивать эффективность проведенной антихеликобактерной терапии
3.6. Исследование возможности использования метода ПЦР для выявления факторов патогенности Helicobacter pylori
3.7. Исследование гетерогенности нуклеотидных последовательностей фрагментов гена CagA Helicobacter pylori методом гетеродуплексного анализа
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Уреазный тест прост в выполнении, не требует особой квалификации медицинского персонала, относительно дешев, позволяет быстро получить ответ (в зависимости от модификации теста результат читается через несколько минут, максимально - через 24 ч). Чувствительность этого теста составляет от 65 до 95 %, а специфичность - от 75 до 100 % (Кишкун А.А., 2002). Однако, уреазный тест - инвазивный метод, а если в стоимость исследования включать эндоскопию, то цена уреазного теста оказывается не такой и низкой. Отрицательной стороной быстрого уреазного теста является высокая вероятность ложноположительных результатов. Что, по - видимому, объясняется контаминированием материала другими уреазопродуцентами. Быстрота изменения окраски индикатора в тесте зависит от уреазной активности, которая в свою очередь определяется количеством бактерий в пробе. При малом количестве бактерий изменение окраски может произойти через несколько часов, а иногда возможен и ложноотрицательный результат.
В настоящее время разработано большое количество промышленно изготовленных уреазных тестов: Де-Нол-тест, CLO-тест, PyloriTek.
Предложение некоторых авторов (Рожавин М.А., Сологуб В.В., Микитюк И.Б., 1989) определять уреазную активность в желудочном соке не нашло применения в клинической практике.
1.3.4. Уреазные дыхательные тесты.
На уреазной активности Я. pylori также основаны радионуклидные, изотопные методы диагностики инфекции, неинвазивные и косвенные -

уреазные дыхательные тесты с мочевинои, меченной изотопами углерода С, 14С (Лапина Т.Л., 1999). Меченная мочевина дается пациенту в составе пробного завтрака. Одним из продуктов разложения мочевины уреазой Я. pylori является углекислый газ, сохраняющий меченный углерод. Углекислый газ с кровотоком доставляется в легкие и выводится с выдыхаемым воздухом. Анализируя изотопный состав выдыхаемого воздуха, делают заключение об инфицированности Я. pylori. В дыхательных тестах применяют мочевину,