Генетические маркеры жизнеспособности и персистенции Mycobacterium tuberculosis на моделях in vitro

• Автор: Обозова, Татьяна Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.07, 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 101 с. : ил.

I. Список сокращений
II. Введение
III. Обзор литературы
1. Механизмы длительного выживания микобактерий М. tuberculosis
2. Модели персистенции М. tuberculosis in vitro
2.1. Модель - «без перемешивания»
2.2. Модель - «с перемешиванием»
2.3. Модель - «стационарная фаза роста»
3. Пути получения энергии М. tuberculosis при персистенции
in vitro
4. Экспрессия генов «dormancy» - регулона М. tuberculosis при персистенции in vitro
5. Экспрессия генов, не входящих в состав «dormancy» - регулона М. tuberculosis при персистенции in vitro
6. Экспрессия генов, кодирующих сигма - факторы М. tuberculosis при персистенции in vitro
7. Определение жизнеспособности М. tuberculosis
8. Особенности фенотипических методов определения жизнеспособности М. tuberculosis
8.1. Определение жизнеспособности М. tuberculosis с использованием репортерных микобактериофагов, несущих ген люциферазы
8.2. Определение жизнеспособности М. tuberculosis посредством мониторинга уровня рРНК
8.3. Определение жизнеспособности М. tuberculosis посредством мониторинга уровня мРНК
IV. Материалы и методы
1. Штаммы микобактерий и условия их культивирования (модели
персистенции in vitro)

2. Состав сред, используемых для культивирования микобактерий
3. Выделение тотальных нуклеиновых кислот (НК)
4. Выделение тотальных рибонуклеиновых кислот (РНК)
5. Конструирование внутреннего калибровочного стандарта (ВКС) для определения количества мишени с использованием реакции обратной транскрипции (ОТ) и полимеразной цепной реакции (ПЦР)
6. Применение внутреннего калибровочного стандарта для определения количества мишени в ПЦР и ОТ-ПЦР реакциях
7. Подбор праймеров для количественных ПЦР и ОТ-ПЦР систем
8. Условия проведения реакции обратной транскрипции
9. Условия проведения ПЦР реакции
10. Характеристика количественных ПЦР и ОТ-НЦР систем
11. Детекция продуктов амплификации
12. Програмное обеспечение экспериментальной работы
V. Результаты и обсуждение
1. Исследование генов М. tuberculosis в качестве маркеров жизнеспособности и персистенции
2. Разработка количественных ПЦР и ОТ-ПЦР систем для изучения экспрессии генов М. tuberculosis
2.1 Тестирование специфичности ПЦР и ОТ-ПЦР систем
2.2 Внутренние калибровочные стандарты (ВКС)
2.3 Определение чувствительности количественных ПЦР и ОТ-ПЦР систем
2.3.1. Определение чувствительности количественных ПЦР систем
2.3.2. Определение чувствительности количественных ОТ-ПЦР систем
2.4 Многопраймерная реакция обратной транскрипции
2.5. Использование ВКС для количественного определения исследуемой мишени в ПЦР и ОТ-ПЦР системах

Определение оптимального количества внутреннего калибровочного стандарта (ДНК-ВКС) для количественных ПЦР систем
Определение оптимального количества внутреннего калибровочного стандарта (РНК-ВКС) для количественных ОТ-ПЦР систем Определение исходного количества числа копий ДНК (мРНК) мишени в препарате
Тестирование образцов на отсутствие деградации РНК
Выбор нормировочного маркера для сравнительного исследования количества специфических мРНК Исследование генетических маркеров жизнеспособности М. tuberculosis на моделях in vitro
Подбор системы ген - индуктор, позволяющей увеличить количество специфических мРНК М. tuberculosis в исследуемом образце в пересчете на количество геном - эквивалента Исследование генов dnaK, sigH и fbpB в качестве маркеров жизнеспособности М. tuberculosis
Исследование гена dnaK в качестве маркера жизнеспособности как показателя действия рифампицина и изониазида на референс -штаммы М. tuberculosis
Исследование генетических маркеров персистенгция М. tuberculosis на моделях in vitro
Использование молекулярно - генетических маркеров для нормирования состояния клеточной популяции М. bovis BCG в условиях моделей персистепции in vitro
Исследование динамики изменения экспрессии генов М. bovis BCG на разных стадиях персистепции на моделях in vitro
Исследование корреляции между уровнем экспрессии генов sigF, dosR, acr, Rv2623 и уровнем толерантности персистентной культуры М. bovis BCG к рифампицину и метронидазолу

Определение НПЧ количественных ОТ-ПЦР систем проводили путем прямого титрования стандартных препаратов РНК-С и РНК-ВКС (аналогично определяли НПЧ для ПЦР систем), учитывая значения эффективности реакции ОТ для каждого исследуемого гена (Таб. 7).
2.5. Использование внутренних калибровочных стандартов (ВКС) для количественного определения исследуемой мишени в ПЦР и ОТ-ПЦР реакциях.
Технология использования ВКС заключается в добавлении к ПЦР или ОТ-ПЦР-смеси известного стандартного количества ВКС и дальнейшее определение количества амплифицируемой мишени, принимая равенство интенсивности сигналов на электрофореграмме от продуктов амплификации (ВКС и мишени) за равенство их количеств (Рис.4).
2.5.1.Определение оптимального количества внутреннего
калибровочного стандарта (ДНК-ВКС) для количественных ПЦР систем.
Определение максимально чувствительного количества ДНК-ВКС, добавляемого к ПЦР-смеси было проведено путем относительного титрования известных количеств ДНК - ВКС и ДНК - С для каждой ПЦР - системы.
За максимально чувствительное количество ДНК-ВКС принимали то количество ДНК-ВКС, при котором наименьшие изменения в количестве мишени (ДНК-С) приводили к изменению в соотношении интенсивности сигналов продуктов амплификации на электрофореграмме (Рис. 9).
При использовании ДНК-ВКС в количестве 2 - 4-х кратных количеств НПЧ, двукратные изменения в количестве мишени ДНК (ДНК-С) приводили к изменению в соотношении силы сигналов на электрофорезе от продуктов амплификации. При использовании 8-и кратных количеств НПЧ и более, двукратные изменения в количестве мишени не приводили к изменению соотношения силы сигналов на электрофорезе от продуктов амплификации ВКС и мишени (Рис. 10).